PCR-SSCP Y

1
PCR-SSCP Yöntemiyle, Türk Charcot-Marie-Tooth
Hastalarinin MPZ, PMP22 ve Cx32 Genlerinin
Mutasyon Analizi

• Ayaz Najafov, Ibrahim Baris, Esra Battaloglu
• Bogazici Üniversitesi
• Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

2
CMT Nedir?

• Charcot-Marie-Tooth (CMT) Herediter Motor ve
  Duysal Nöropati (HSMN)
• Görülme frekansi 1/2500
• Distal kol ve bacak kas zayifligi ve duysal
  bozukluklar
• Genetiksel ve kliniksel olarak heterojen bir
  hastaliktir
• 17 farkli gen
• Otozomal baskin, otozomal çekinik ve X-linked

3
Gen-Hastalik
Gen Sebep Oldugu Hastalik
Myelin Protein Zero (MPZ) CMT1B, CMT2, DSS
Peripheral Myelin Protein 22 (PMP22) CMT1A, DSS, HNPP
Connexin 32 (Cx32) CMTX
4
3 genin taranmasi

• 51 hastanin subtype tanimlanmasi
• MPZ, PMP22 ve Cx32
• PCR-SSCP
• noktasal mutasyonlar

5
PMP22

• 17p12-11.2
• 40 kb 2 intron ve 4 ekson
• 160 aa / 22 kDa protein
• 4 transmembran bölge
• Miyelin proteinlerinin 5-10
• Schwann hücrelerinin ERunda anlatiliyor
• Farklilasmis Schwann hücrelerinin Go fazinda
  devamliligi
• Adhesyonda fonksiyon
• Noktasal mutasyonlar ve gen kopya dozu

6
MPZ

• 1q2223
• 7 Kb / 6 ekson
• 219 aa / 28 kDa protein
• 1 transmembran bölge
• Immunoglobulin ailesinin üyesi
• Miyelin proteinlerinin 50-60
• Periferik sinir miyelinin yapisi ve fonksiyonu
• Kültür hücrelerinde hemofilik adhesiyonu sagliyor
• Diger Schwann hücresi proteinlerinin dogru
  yerlere dagitilmasi

7
Cx32

• Xq13.1
• 283 aa / 32 kDa protein
• 2 kodlamayan (alternatif spicing ile
  doku-spesifik anlatiliyor) ve 1 kodlayan ekson
  var
• 4 transmembran bölge, 1 hücreiçi ve 2 hücredisi
  bölge ve termini
• Gap junction proteinleri ailesi
• Gap junctionlarin bozulmasi halinde, önemli
  hücreiçi pathwaylarin bozuluyor

8
Metotlar
Hasta genomik DNAsi
Bir eksonun PCR ürünü
2 agarose gel check
8 non-denaturing acrylamidebisacrylamide (291)
gels
SSCP boyasi Formamide, EDTA, BPB, XC

PCR ürünü
16 saat oda sicakliginda 10-15V/cm
0.6X TBE buffer
Gümüs nitrat boyamasi
9
Sonuçlar
10
Sonuçlar Dizi Analizi
11
Sonuçlar Restriksiyon Analizi
12
Sonuçlar

• P126 nolu hastada, Cx32 geninin ikinci
  eksonunda, ikinci hücredisi bölgesini etkileyen
  hemizigot 556 G?A 186 glutamine?lysine mutasyonu
  bulundu.
• P180 nolu hastanin Cx32 geninde yeni mutasyon
  çesidi bulundu 472 C?A (Pro158Thr).

13
Tartisma

• 2/51, 4
• henüz belirlenmemis genetik bölgeler
• SSCP tekniginin mutasyon tespit edebilme yüzdesi
• Gliserol (5) bazi fragmanlar için olumlu,
  bazilari için ise olumsuz sonuçlar verdi.

14
Referanslar

• Baris I., 2002, Short Tandem Repeat And Mutation
  Analyses In Turkish Charcot-Marie-Tooth
  Patients, MS Thesis, Bogazici University,
  Department of Molecular Biology and Genetics.
• Shapiro, H., J. P. Doyle, P. Hensley, D. R.
  Colman and W. A. Hendrickson, 1996, Crystal
  Structure of the Extracellular Domain from P0,
  the Major Structural Protein of Peripheral Nerve
  Myelin, Neuron, Vol. 17, pp. 435-449.
• Filbin, M. T., F. S. Walsh, B. D. Trapp, J. A.
  Pizzey and G. I. Tennekoon, 1990, Role of Myelin
  P0 Protein as a Homophilic Adhesion Molecule,
  Nature, Vol. 344, pp. 871-872.
• Giese, K. P., R. Martini, G. Lemke, P. Soriano
  and M. Schachner, 1992 Mouse P0 Gene Disruption
  Leads to Hypomyelination, Abnormal Expression of
  Recognition Molecules, and Degeneration of Myelin
  and Axons, Cell, Vol. 71, pp. 565-576.