Leucmognse

1
Leucémogénèse

• MASTER 1
• IMMUNO-HEMATO FONDAMENTALE et PATHOLOGIQUE
• 12 octobre 2006

2
Plan

• I-définition
• II- rappels physiopathologiques
• III- leucémogénèse concepts généraux
• A- approche générale
• B- translocations chromosomiques
• C- anomalies géniques sans altération
  chromosomique
• D- classification
• E- leucémogénèse multi-étapes
• IV-leucémie myéloïde chronique. T(922)
• V- leucémies aiguës à CBF. Exemple de T(821)
• VI- FLT3 et leucémie
• VII- leucémie aiguë à promyélocytes. T(1517)

3
I-Définition

• Leucémogénèse ensemble des mécanismes
  responsables de la transformation dune cellule
  normale en cellule leucémique.
• Importance de la cellule dorigine cf cellule
  souche leucémique
• Importance des événements oncogéniques nont pas
  tous la même valeur et chacun a des effets
  propres

4
II- rappels physiopathologiques hématopoïèse
CSH
Progéniteur lymphoïde CFU-L
Progéniteur myéloïde CFU-GEMM
BFU-E
CFU-Mega
CFU-Eo
CFU-B
CFU-GM
Thymus
CFU-E
Méga-caryocyte
GR
PNE
PNB
PNN
Lymphocytes B et T
Monocyte
Plaquettes
5
Hémopathies malignes MYELOIDES
CSH
Hémopathies myéloïdes
Progéniteur lymphoïde CFU-L
Progéniteur myéloïde CFU-GEMM
BFU-E
CFU-Mega
CFU-Eo
CFU-B
CFU-GM
Thymus
CFU-E
Méga-caryocyte
GR
PNE
PNB
PNN
Lymphocytes B et T
Monocyte
Plaquettes
6
Hémopathies myéloïdes
CSH
Hémopathies myéloïdes
Progéniteur lymphoïde CFU-L

• Immatures
• LAM
• MDS

Progéniteur myéloïde CFU-GEMM
BFU-E
CFU-Mega
CFU-Eo
CFU-B
CFU-GM
Thymus
Matures Sd myéloprolifératifs
CFU-E
Méga-caryocyte
GR
PNE
PNB
PNN
TE
SHE
Lymphocytes B et T
LMC
Monocyte
Splénomégalie myéloïde
Plaquettes
Vaquez
7
Hémopathies myéloïdes

• Leucémie myéloïde chronique (LMC)
• Sd myéloprolifératif
• prolifération anormale de cellules de la lignée
  myéloïde
• maintien dune différenciation normale
• diagnostic biologique hyperleucocytose à PNN
  basophiles éosinophiles. Myélémie sans hiatus de
  maturation. Thrombocytose.
• chromosome Philadelphie t(922). Bcr-Abl p210
• évolution en 3 phases chronique? accélérée ?
  blastique (LAM)
• Leucémies aiguës myéloblastiques (LAM1 à 7)
• prolifération de cellules myéloïdes immatures
  (blastes), caractérisée par un blocage de la
  différenciation, variable en fonction du sous
  type de LAM
• diagnostic gt20 de myéloblastes ds la MO
• - importance analyse cytologique, phénotype, CG
  et moléculaire

8
Hémopathies malignes LYMPHOIDES
CSH
Hémopathies lymphoïdes
Progéniteur lymphoïde CFU-L
Progéniteur myéloïde CFU-GEMM
BFU-E
CFU-Mega
CFU-Eo
CFU-B
CFU-GM
Thymus
CFU-E
Méga-caryocyte
GR
PNE
PNB
PNN
Lymphocytes B et T
Monocyte
Plaquettes
9
Hémopathies lymphoïdes
Hémopathies lymphoïdes
Progéniteur lymphoïde CFU-L

• Leucémies aiguës lymphoblastiques
• - prolifération de cellules lymphoïdes immatures
  (blastes)
• - diagnostic gt20 de myéloblastes ds la MO
• Lymphomes.Leucémies matures
• - Anomalies du tissu lymphoïde mature
• - hétérogénéité clinique et biologique

Immatures LAL
Thymus
Matures LLC Lymphomes
Lymphocytes B et T
10
III- Leucémogénèse concepts généraux

• Leucémies pathologies acquises, clonales
• oncogénèse oncogènes/ gènes suppresseurs de
  tumeurs
• sporadiques (très peu de cas familiaux)
• ? nécessité caractérisation CG et moléculaire
  des différentes leucémies
• gt100 mutations différentes ou réarrangements de
  gènes ds LAM
• CG - translocations
• - mutations ponctuelles et réarrangement de
  gènes infrachromosomiques

11

• A- approche générale

c-MYC ABL
c-MYC sous promoteur IgH BCR-ABL
T(814) LNH Burkitt T(922) LMC
12
B- Translocations réciproques et leucémogénèse (1)
Points de cassure
b.
b.
a et b anormaux
Points de cassure
a.
a.
13
Translocations réciproques et leucémogénèse (2)

• Surexpression dun oncogène (de structure
  normale)
• gène sous dépendance dun promoteur fort
• essentiellement dans les lymphopathies et les LAL
• réarrangement Ig et TCR au cours de lymphopoïèse
  
• cassure dADN ? favorise recombinaison
  anormale
• T(X14) gène sous dépendance promoteur fort
  IgH
• ? surexpression dun oncogène c-Myc, Cycline
  D1, Bcl2
• Protéine de fusion
• propriétés différentes de chacun des protéines
  partenaires par ?mécanismes
• - modification du niveau dexpression
• - modification de la localisation
  intracellulaire
• - modification de lactivité de la protéine
• Protéines de fusion fréquemment retrouvées ds
  LMC, LAM et LAL B et biphéno de lenfant

14
Translocations réciproques et leucémogénèse (3)

• Protéines impliquées par translocations ds
  leucémies
• Protéines jouant un rôle ds hématopoïèse
  (différenciation)
• RAR?, tjs impliqué ds LAM3 (promyélocyte)
• AML1 impliqué ds LAL-B de lenfant t(1221)
  TEL-AML1
• LAM de ladulte T(821) ETO-AML1
• Protéines de fusion impliquant une protéine à
  activité TK
• En général ? activité TK constitutive
• Soit R à acté TK PDGF-R, ALK, FGFR1
• Soit prot à acté TK intra cellulaire ABL, ARG,
  JAK2
• Nature de séquence en amont peut modifier
  fonction de protéine de fusion (cf BCR-ABL p190
  et p210)

15
C- Altérations génétiques sans anomalies CG

• mutations ponctuelles
• microdélétions ? activation
  doncogènes
• Essentiellement,
• Mutations de gènes impliqués ds transduction du
  signal (N-RAS, K-RAS)
• Mutations de R à activité TK FLT3, c-KIT
• Mutations de FT impliqués ds lhématopoïèse
  c/EBP?, mutations AML1

16
D- anomalies géniques responsables de
leucémogénèse

• Classification selon type danomalie génétique
• Classification selon conséquence fonctionnelle
• aN activant cascade de transduction du signal/
  aN aboutissant à une dérégulation
  transcriptionnelle

translocations
mutations ponctuelles
dérégulation transcritionnelle de gènes impliqués
ds différenciation
aN de la cascade de transduction du signal
avantage prolifératif
aN de la différenciation
17
E- Leucémogénèse processus multi étapes(1)

• 1- généralités
• anomalies récurrentes, associées à un type de
  leucémie. Mécanisme causal?
• souvent insuffisantes à elles seules pour donner
  leucémie, en tous cas, LA. Ds LMC BCR-ABL
  suffisant
• Arguments
• Jumeaux syngéniques TEL-AML1 in utéro. Latence
  et variabilité de survenue dune LAL-B
• Analyse sang de cordons ETO-AML1 100x fréquent
  que incidence de LAM
• Existence de prédispositions génétiques à LAM
  FPD mutations de AML1, latence avant LAM
• Exemple de évolution LMC
• T(14 18) présente chez des sujets sains???
• En général, pas dassociations transloc entre
  elles ni mutations de TK ou transduction du signal

18
2- modèle en 2 étapes (Gilliland)
Leucémogénèse processus multi étapes(2)
avantage prolifératif (aN transduction signal et
TK)
blocage de différenciation (aN FT impliqués ds
hématopoïèse)
CBF RARa Réarr MLL Co activateurs C/EBP?
bcr-abl TEL-PDGFRß RAS FLT3 autres TK activées
19
Leucémogénèse processus multi étapes(3)
3- réalité complexe
blocage de différenciation
avantage prolifératif
CBF RARa Réarr MLL Co activateurs C/EBP?
bcr-abl TEL-PDGFRß RAS FLT3 autres TK activées
LEUCEMIE AIGUE
auto-renouvellement
autres
WNT Notch Bmi-1 Hox
apoptose? ?
20
IV modèle de la leucémie myéloïde chronique
A- rappel physiopathologie

• Sd myéloprolifératif
• Stimulation lignées myéloïdes, essentiellement
  granuleux
• chromosome Philadelphie T(922) ? BCR-ABL
• Modèle de leucémogénèse
• Évolution en 3 étapes chronique/ accélérée/
  blastique ( LAM)
• Chaque étape agressivité supplémentaire,
  acquisition aN CG et perte de différenciation

21
B- anomalie cytogénétique récurrente t(922)
22
C- conséquences moléculaires de t(922)
1- structure et fonction des protéines partenaires

• Protéine Abl normale
• TK non R
• fonction complexe
• Intègre signaux extra et intra C et
  influence réponse cellulaire cycle cellulaire,
  apoptose..

• Protéine bcr normale
• sérine-thréonine K
• fonction mal connue

23
2- transcrits de fusion BCR-ABL
p190
p210
p230
Fraction ABL? constante fraction BCR variable
24
D- mécanismes de transformation t(922)

• Dérégulation de lactivité TK de Abl activation
  constitutive
• Altération de la fonction auto-inhibitrice de SH3
  par fusion avec BCR,
• Conséquences fonctionnelles
• 1- activation constitutive de signaux mitogènes
• ? activation voie RAS-MAP kinases
• ? activation voie JAK-STAT
• ? activation PI3Kinase
• ? activation voie Myc
• 2- altération de ladhésion aux C stromales et
  MEC
• Stroma régule négativement prolifération
  cellulaire. IFN? réverse aN dadhésion. Rôle
  intégrines
• 3- réduction de lapoptose
• - via Bcl2
• - phosphorylation de Bad (proapoptotique)

Effets PROLIFERATIFS et ANTI-APOPTOTIQUES
25
E- biologie de la crise blastique de LMC

• Évolution inéluctable de toute LMC (délai médian
  5 ans)
• Augmentation prolifération et survie des cellules
  arrêt de différenciation
• anomalies cytogénétiques supplémentaires
  fréquentes
• coopération entre Bcr-Abl et anomalies génétiques
  surajoutées
• Bcr-Abl favorise instabilité génomique dc
  anomalies 2daires
• anomalies de p53 ou Rb
• anomalies de gènes de différenciation C/EBP

26
F- LMC aspects thérapeutiques

• autrefois AraC-IFN
• allogreffe de CSH seul Ttt curateur
• développement dun inhibiteur de TK STI 571
  (Glivec)
• - compétition ave ATP pour fixation poche à ATP?
  pas de Pylation
• rémissions CG et moléculaires complètes sous
  Glivec seul
• apoptose cellules LMC Bcr-Abl
• efficacité surtout en phase chronique, moins ds
  phases avancées
• rechute à larrêt du traitement
• pas deffet sur cellules souches leucémiques
• apparition de résistances par mutations ds
  domaine kinase

27
V modèle des leucémies aiguës à CBF

• A- Core Binding Factors définition

• Régulateurs transcriptionnels,
  hétérodimériques.
• -rôle ds lhématopoïèse normale.
• -cible fréquente de remaniements géniques au
  cours de la leucémogénèse.
• 2 sous-unités
• - CBFa, se liant à lADN
• - CBFß, ne se liant pas à lADN, mais
  augmentant laffinité de la liaison CBF -ADN

28
B- Structure des Core Binding Factors Sous-unité
?
-Forte homologie avec la protéine RUNT de la
drosophile -Caractéristique fixation à lADN
( Core-site ) -3 sous-unités distinctes chez
les mammifères -CBFa1 (AML3 RUNX )
OSTEOGENESE -CBFa2 (AML1 RUNX1)
HEMATOPOIESE -CBFa3 (AML2) rôles multiples
T(821) T(1621)
T(321)
T(1221)
51
453
Runt domain
N-term
C-term
DNA-binding CBFß-binding
AML1 Gène sur chro 21q22
Transactivation, interactions protéiques
29
B- Structure des Core Binding Factors Sous-unité
?
- 1 seule variété CBFß - pas de fixation à
lADN. - augmente laffinité de la liaison CBF
ADN. - protège CBFa de la protéolyse.
30
C- Core Binding Factors Core Site séquence
consensus dADN

• Séquence dADN consensus,
• régions régulatrices de promoteurs de gènes dont
  certains sont spécifiques de lhématopoïèse
• Gènes cibles impliqués ds hématopoïèse
• -cytokines IL3,GM-CSF
• -MCSF-R
• -protéines spécif. Myéloïdes MPO, élastase
  neutrophile, sérine protéase granzyme B
• -Chaînes a et ß du TCR
• -inhibiteurs de kinase cycline-dépendantes
  p21...

31
D- CBF organisateur transcriptionnel (1)

GENES CIBLES ? HEMATOPOIESE IL3, GM-CSF,
protéines myéloides, chaines du TCR
RHD
CBFß

• CBS sites de fixation dautres facteurs de
  transcription (cMYB, ETS,..)
• Interaction de CBF avec dautres protéines
  régulatrices
• - LEF-1 lie lADN, modification
  conformationnelle du brin dADN ?interactions
  protéiques. Stabilisation par ALY
• - interaction avec des co-activateurs
  transcriptionnels p300/CBP, liant dautres prot.
• ?activité histone-acétyl-transférase (HAT)

32
D- CBF organisateur transcriptionnel (2)
LEF-1
ALY
AML1
C-Myb C/EBPa
RHD
CBFß
CBF? COMPLEXE TRANSCRIPTIONNEL ? ACETYLATION ?
ACTIVATION TRANSCRIPTION
33
E- CBF rôle dans lhématopoïèse (1)
34
E- CBF rôle dans lhématopoïèse (2)

• CBFa et CBFß indispensables à lhématopoïèse
  définitive (émergence de CSH)
• Pas de rôle dans lhématopoïèse primitive
• Modèles murins
• -inactivation homozygote de CBFa ou ß
• ? décès entre J11,5 et J13,5 dhémorragie du
  SNC
• ? absence totale dhématopoïèse définitive
• ? hématopoïèse Ive normale
• -hétérozygotes pour mutation dAML1
• ? développement normal
• ? progéniteurs Hp /2 niv foie foetal

35
F- CBF et leucémogénèse (1)

• CBFs cibles potentielles de
• - translocations
• - mutations ponctuelles (germinales (FPD), ou
  sporadiques)
• Au moins 12 translocations décrites, impliquant
  CBFa ou ß.
• (25 LAM adulte. 25 LAL enfant)
• Fusion de gène codant pr AML1 ou CBFß
• - gène partenaire ? ptés oncogéniques
• Protéines de fusion oncoprotéines
• ? modification des propriétés de CBF par un
  effet dominant négatif

36
F- CBF et leucémogénèse (2)

• T(821)(q22q22)
• ? ETO-AML1
• 12LAM (M2)
• Inv(16) ? CBFß-MYH11
• 6LAM (M4Eo)
• T(1221)(p13q22)
• ?TEL-AML1
• 25LAL B enfant
• T(321)(q26q22)
• ?AML1-MDS1
• AML1-EVI1

37
F- CBF et leucémogénèse (3) Modèle de
T(821)(q22q22) ETO-AML1
1
177
RHD

• AML1 (RHD) ? -liaison à lADN
• - hétérodimérisation avec CBFß
• - perte du
  domaine de transactivation AML1
• ETO ? - homo-hétérodimérisation avec autres
  MTG
• - interaction avec complexe co-répresseur
  nucléaire

38
F- CBF et leucémogénèse (4) Modèle de T(821)
oncoprotéine ETO-AML1
HDAC
N-coR
ETO AML1
Sin3a
RHD
CBFß

• ETO-AML1?? recrutement de COREPRESSEURS
• Activité HISTONE DEACETYLASE
• REPRESSION TRANSCRIPTIONNELLE

39
F- CBF et leucémogénèse (5) Autres translocations

• T(1221)(p13q22) ?TEL-AML1
• TEL - motif doligomérisation
• - domaine central de répression
• AML1 RHD TAD ? balance activation/répression
• Inv(16) ?CBFß-MYH11
• - séquestration de CBFa ds complexes non
  fonctionnels.
• - domaine de répression
• ?REPRESSION TRANSCRIPTIONNELLE
• Mécanismes en partie similaires à PML-RARa (
  N-coR)

Recrutement de N-coR
40
F- CBF et leucémogénèse (6) Conclusions

• Translocations chromosomiques
• ? protéines chimériques oncoprotéines
• ? effet dominant négatif sur la fonction
  normale de CBF
• ? répression transcriptionnelle de gènes cibles
  de CBF (? anomalies différenciation
  hématopoiétique)
• Répression médiée par recrutement aberrant de
  complexes corépresseurs transcriptionnels,
  activité histone déacétylase ( T(821),
  t(1517),)

41
F- CBF et leucémogénèse (7) Conclusions

• Nécessité de secondes mutations
• Concernent des protéines impliquées dans la
  prolifération et la survie cellulaire
• (récepteurs TK de progéniteurs myéloïdes précoces
  FLT3, c-KIT,)
• Données récentes
• Mutations de FLT3 30 à 35 des LAM (ITD ou
  autres mutations) ? activation TK

42
VI- mutations FLT3 ds les LAM
A- structure et fonction de FLT3

• - chromosome 13q12. 24 exons
• expression sur progéniteurs médullaires,
  thymiques, ganglions
• récepteur à activité TK type III
• structure
• fonction rôle ds hématopoïèse normale précoce
  par fixation de FLT3 ligand et autres CK
• interaction FLT3-FLT3-L
• dimérisation du R ? autoPylation s/ K
• Phosphorylation des substrats cytoplasmiques
• Voie de signalisation régulant prolifération

43
B- mutations de FLT3 et leucémie (1)

• duplication interne en tandem (15-20 LAM)
• ARNm longs, niv domaine JM (exon 14, 15)
• duplication en tandem dune séquence, de taille
  et de localisation variable ms tjs JM
• cadre de lecture conservé
• conséquence
• dimérisation et Pylation indépendt de fixation
  dun ligand
• pylation de FLT-3 WT
• indépendance/ F croissance
• activation constitutive de mol de signalisation
  sous jacentes (STAT5, MAPK, Akt)
• mécanismes
• gain de zones de fixation SH2 ?
• bloque rôle inhibiteur de JM

Prolif accrue bloc différen
44
B- mutations de FLT3 et leucémie (2)

• mutations domaine Kinase
• mutation AA 835 et 836 boucle dactivation
• boucles dactivation empêche accès ATP et
  substrat au dom kinase.
• fixation ligand ? pylation boucle activation
  forme active
• mutation gain de fonction
• ? Pylation constitutive FLT3
• ? indépendance / F croissance

45
B- mutations de FLT3 et leucémie (3)

• mutations de FLT3 seules ne suffisent pas à LA
• transduction rétrovirale de FLT3-ITD
• ? Sd myéloprolifératif
• coopération particulière avec certaines aN CG
• -T(1517)
• - MLL
• - peu avec LAM CBF

46
VII modèle de la LAM3leucémie aiguë
promyélocytaire
A- rappel physiopathologique

• blocage de différenciation au stade promyélocytes
• Caractéristiques cytologiques particulières MPO,
  corps dAuer en fagots
• Urgence hématologique risque de CIVD
• Caractéristique t(1517)
• autres t(X17) impliquant RAR?
• Pronostic transformé par utilisation ATRA et plus
  récemment Arsenic (agents différenciants effets
  proapoptotiques de AsO3)

47
B- anomalies cytogénétiques de LAM3 (1)

• Anomalie CG récurrente

T(1517)(q22q21) fusion PML-RAR?

• 4 translocations variantes

T(11,17)(q23q21) fusion PLZF - RAR?
(0,8) T5,17)(q35q21) fusion NPM- RAR?
(lt0,5) T(11,17)(q13q21) fusion NUMA-RAR?
(très rare) del(17) fusion STAT5b RAR? (très
rare)

• ? RAR? tjs impliqué rôle central ds
  transformation
• autre partenaire protéine nucléaire. domaine de
  dimérisation
• point commun prot nucléaire capables de former
  homodimères X-RAR?
• PML probablement rôle propre de cette protéine

48
C-structure et fonction des protéines partenaires
1- RAR? (17q21)

• récepteur nucléaire de lacide rétinoïque
• liaison à lADN (RARE) après hétérodimérisation
  avec un autre récepteur nucléaire RXR
• FT, régulateur tanscriptionnel
   hormone-inductible 
• régulation de gènes cibles en présence dAR
• rôle ds la maturation myéloïde

activation transcriptionnelle AF-1
inconnu
Coiled-coil domain
A
B
C
D
E
F
Liaison ADN
Fixation ligand Hétérodimérisation Activation
transcriptionnelle AF-2 Liaison co-Act, co-R
49
Fonction physiologique de RAR? (en absence
dacide rétinoïque)
50
Fonction physiologique de RAR? (en présence
dacide rétinoïque)
DIFFERENCIATION MYELOIDE
51
2- PML (15q22)

• fonctions mal connues
• effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques
• gt contrôle de la prolifération et de la survie
  cellulaire
• localisation nucléoplasmique et corps nucléaires
  ( association à dautres protéines CBP, Daxx,
  ..)
• CBP favorise acétylation des histones? activ
  transcription linteraction CBP-PML peut
  expliquer les effets modulateurs de PML sur la
  transcription
• - Daxx voie apoptotique
• - PML-/- aN de la différenciation
• domaine de dimérisation

52
D- Protéine de fusion X-RAR?
PML (15q22) Pomyelocytic Leukemia
RAR? (17q21)
PLZF (11q23) Promyelocytic Leukemia Zinc Finger
NMP (5q35) Nucleophosmin
N/RAR?
NuMA (11q13) Nuclear Matrix Associated
fig. 3
53
Protéine de fusion PML-RAR?
1- structure
Maintien des domaines importants de chacun des
partenaires - PML motif RBCC (homodimérisation
et interaction protéine-protéine) - RAR?
fixation ADN, activation transcription en
présence ligand, hétérodimérisation RXR
RAR?
PML
bcr 1 (L type)
3 4 5 6
3
bcr 2 (V type)
3
3 4 5 6
bcr 3 (S type)
3
3
3 transcripts majeurs PML/RAR?
54
Protéine de fusion PML-RAR?
2- conséquences fonctionnelles modification
fonction RAR?
- PML-RAR? formation hétérodimères RXR
formation homodimères PML-RAR ?- PML-RAR ? -
RAR? affinité pour les corépresseurs gt RXR, ?
liaison plus forte avec N-coR et SMRT ?
recrutement HDAC ? effet dominant négatif
? répression de transcription aux doses
physiologiques dAR
HDAC
55
Protéine de fusion PML-RAR?
3- impact thérapeutique effet de doses
pharmacologiques dAR

• - affinité coR gt pour X-RAR?
• - déplacement courbe dactivation gènes cibles
  par lAR vers des C fortes
• doses pharmacologiques dAR (ATRA) détachement
  coR et HDAC ? recrutement HAT ? reprise de
  la différenciation

HAT
REPRISE de la DIFFERENCIATION MYELOÏDE
56
Protéine de fusion PML-RAR?
4- conséquences fonctionnelles modification
fonction PML

• PML-RAR? effet dominant négatif sur fonction
  de PML ?
• 4 membres de la même famille impliqués ds
  protéines de fusion oncogène ? rôle propre de PML
  ds leucémogénèse ?
• PML rôle antiprolifératif et pro-apoptotique
• PML-RAR? délocalisation de PML et de ses
  protéines partenaires (CBP et Daxx) en DH des
  corps nucléaires.
• délocalisation? dysfonctionnement ?
• - blocage effet antiprolifératif et apoptose ?
  prolifération cellulaire?

57
Autres protéines de fusion X-RAR?

• mécanisme daction commun
• effet dominant négatif de la protéine
  chimérique.
• blocage de la différenciation myéloïde
• effet thérapeutique dépendant de la nature du
  produit de fusion
• AR efficace sur NPM-RAR? et sur NuMA-RAR?
• aucun effet sur PLZF-RAR?
  (PLZF domaine
  suppl dintéraction avec co-R, insensible à
  action AR)
• AsO3 semble avoir un effet propre sur PML
  (relocalisation ds CN)

58
VIII leucémogénèse vers des thérapeutiques
ciblées ?