Presentaci

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CONSERVACIÓN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS
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Colección de Cultivo y servicio que ofrece
Qué son las Colecciones de Cultivo? - Son
organizaciones que principalmente se ocupan de
guardar convenientemente cepas de
microorganismos,células superiores o diversos
materiales biológicos y los suministran, previa
petición,a laboratorios microbiológicos o de
biología celular.
- Son por lo tanto servicios de apoyo a los
trabajos de microbiología
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Cuándo aparecieron las primeras colecciones de
cultivo?
-Kral (Praga, siglo XIX) fue la primera en tener
catálogo -La más antigua Lobaina (Belgica)
(Hongos) -La ATCC,en 1925.No vinculos directos
con la Universidad,es de carácter comercial
(Manassas,USA). -La CECT,nace en el
CSIC(Villanueva)(1960). -PRCC ,Profesor J.L.Ramos
(Pseudomonas putida)
A partir de 1972 las CC se agrupan en la
organizacion internacional denominada World
Federation for Culture Collection (WFCC). En
Europa a su vez estan agrupadas en la European
Culture Colletion Organization (ECCO) que se
fundó en 1982.
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Servicios que prestan las Colecciones de Cultivos
1.-Recolección,conservación y suministro de cepas
microbianas. -Recolección Es el servicio mas
típico de una CC.Las colecciones reunen cepas
que les llegan a traves de distintos conductos,la
s conservan convenientemente y las suministra
previa petición. -Conservación -Suministro
Se hace por correo de superficie,aéreo o
mensa- jería,pero siempre empaquetado
correctamente (tres envueltas) siempre hay que
considerarlo como material potencialmente patóge
no 2.-Recopilación de datos de las cepas
microbianas y difusió de los mismos Fichas,orden
adores,redes electronicas,public.de catálogos
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3.-Servicio de guardería de las cepas
microbianas Se pueden guardar por encargo cepas
microbianas,cobrando una tasa anual y
manteniendo el secreto de este depósito. 4.-Ident
ificaciones microbianas. 5.-Depósito de cepas
microbianas. -Depósito público Cualquier
microbiólogo puede depositar una cepa, que
considere interesante,en la colección. Esta cepa
se incorpora en el catálogo y puede
suministrarsela a cualquier otro microbiólogo que
la solicite. -Depósito no públicoAlgunas CC
reciben el nombramiento de Autoridad
Internacional de Depósito para fines de
patentes,de esta manera se garantiza la
descripción total y reproducción del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente,la cepa
puede suministrarse previa autorización escrita
del propietario,aunque no figure en el catálogo.
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6.-Organización de Cursos 7.-Investigación. 8.-Ase
soramiento en general
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Normas generales para la conservación de
cepas microbianas
Los tres objetivos para una correcta
conservación 1.-Mantenimiento en Cultivo
puro.(PUREZA) 2.-Que este viva.(VIABILIDAD) 3.-La
cepa debe guardarse geneticamente
estable(ESTABILIDAD)

• Lapage en 1977 decía que
• Un cultivo inicial de una especie es una
  población
• Un subcultivo es una población diferente derivada
  de este
• cultivo inicial.
• c) Una cepa es una suceción de subcultivos del
  cultivo inicial

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los datos del cultivo inicial seran los mismos
en la cepa? NO necesariamente porque se producen
cambios en los subcultivos Los métodos en la
conservación de las cepas microbianas tienen Como
objeto fundamental minimizar estos cambios
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La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo
  plazo
• Conservación por congelación
• Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
• Conservación por transferencia periódica
• Conservación por suspensión en agua destilada o
  en agua de mar esteril

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• Métodos Restringidos
• Desecación en papel de filtro
• Desecación en suelos,arena silicagel,etc
• Desecación en bolitas de alginato
• Desecación en sal gorda para halobacterias

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La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo
  plazo
• Conservación por congelación
• Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
• Conservación por transferencia periódica
• Conservación por suspensión en agua destilada o
  en agua de mar esteril

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Conservación de microorganismos por congelación
La crioconservación consiste en la conservación
de los microorganismos a temperaturas inferiores
a cero grados centígrados. Se basa en la
paralización del metabolismo celular por la
disminución del agua disponible. Objetivos de
la crioconservación - Mantenimiento de la
viabilidad -crioprotectores -La temperatura
de almacenamiento -El estado fisiológico de la
célula - Mantenimiento de la estabilidad -
Mantenimiento de la pureza
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Hielo
Hielo
Hielo
H2O
Hielo
BACTERIA
H2O
H2O
H2O
Hielo
Hielo
Hielo
Hielo
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AGENTES CRIOPROTECTORES

• OBJETIVOS
• Minimizar daños durante la congelació.
• Limitar la formación de hielo (tasa de
  congelación)
• Vitrificación del agua

• CARACTERISTICAS
• No tóxico para la célula.
• Penetrar facilmente en la menbrana celular.
• Unirse a los electrolitos o a las moléculas de
  agua.

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Crioprotectores más comunes

• Glicerol
• Dimetilfulfóxido (DMSO)
• Ácido glutámico
• Glucosa
• Sacarosa
• Meso inositol
• Lactosa
• Leche Descremada

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Conservación de microorganismos por congelación
La crioconservación consiste en la conservación
de los microorganismos a temper.inferiores a
cero grados centígrados. Se basa en la
paralización del metabolismo celular por la
disminución del agua disponible. Objetivos de
la crioconservación - Mantenimiento de la
viabilidad -crioprotectores -La temperatura
de almacenamiento (-70º,-139º) -El estado
fisiológico de la célula (Final f.logarítmica) -
Mantenimiento de la estabilidad - Mantenimiento
de la pureza
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Conservación de microorganismos por congelación
La crioconservación consiste en la conservación
de los microorganismos a temper.inferiores a
cero grados centígrados. Se basa en la
paralización del metabolismo celular por la
disminución del agua disponible. Objetivos de
la crioconservación - Mantenimiento de la
viabilidad -crioprotectores -La temperatura
de almacenamiento -El estado fisiológico de la
célula - Mantenimiento de la estabilidad
(fenotípica y genotípica) - Mantenimiento de la
pureza (Hacer alícuotas)
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Conclusiones

• Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o
  final de la fase logarítmica, a la temperatura
  óptima, en el medio más adecuado.
• Ajustar el nº de células a una concentración
  final de 2-6x106 cél/ml. Añadir los
  crioprotectores adecuados a una concentración
  óptima.
• Repartir la suspensión en ampollas de
  congelación,cerrarlas hermeticamente y
  mantenerlas 30 minutos a 30º.
• Disminuir la tª lo mas rápido posible.
• A la hora de recuperar los microorganismos,
  descongelar rápidamente, sumergiendo las ampollas
  con el cultivo congelado en un baño a 37-40ºC.

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La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo
  plazo
• Conservación por congelación
• Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
• Conservación por transferencia periódica
• Conservación por suspensión en agua destilada o
  en agua de mar esteril

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FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA CONSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIÓN

• Liofilización
• Es un método de conservación a largo plazo.
• Se basa en la paralización del metabolismo
  celular por falta de aguacongelación y
  sublimación

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PROCESO
Congelar el agua libre de las células
Eliminación del agua
Agua congelada
Vapor de agua
Sublimación
2ª Fase de la Desecación
1ª Fase de la Desecación
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PROCESO
P R O T E C T O R
Congelación Rápida
Tª ambiente,4ºC,-196ºC
Tubos marcados
BOMBA
BOMBA
condensador
Sellado al vacio
Ampolla
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Tipos de Liofilizadores

• Liofilizador con centrifugación
• Se utilizan ampollas de vidrio taponadas
• La suspensión se centrifuga durante la 1ª fase de
  la desecación
• Se estrechan las ampollas y,después de
  conectarlas a una bomba de vacío,se sellan.
• VentajasSe utiliza la centrifugación para que el
  proceso de congelación sea suave y de forma
  homogénea

• Liofilizador con estantes
• La suspensión se prepara en viales y,es
  precongelada a Tª muy bajas antes de aplicar el
  vacío.
• La segunda etapa de la desecación se realiza
  también en el liofilizador.
• VentajasLa Desecación es de manera progresiva y
  continuada

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Cuándo aplicar la Liofilización?
Es un método ampliamente utilizado para conservar
distintos Microorganismos.
SI
NO
-Dificultad de un crecimiento Adecuado. -Microorg
anismos delicados que no resisten el paso de
congelación. -A tamaños de células mayores,
menos efectivo es el proceso Protozoos,Células
animales, Células vegetales,Arqueobac- terias y
bacterias delicadas
-Bacterias,Levaduras, Hongos,Algunos virus,Algas
EjemplosRhodospirillum, ,Azospirillum,vibrio y
demás bacterias marinas. -Levaduras miceladas
con difi- cultad en la esporulación. -Hongos con
grandes conidios o con dificultad en la
esporulación.
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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL
PROCESO DE LIOFILIZACIÓN
Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo Dependerá del tipo
de microorganismo y sus requerimientos
nutricionales.
Fase de crecimiento del cultivo. F.exponencial.
Suspenciones celulares de 108-109 Células/ml en
bacterias, algo inferiores en hongos y levaduras.
Condiciones de incubación. Tª,aerobiosis,
anaerobiosis, etc.
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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL
PROCESO DE LIOFILIZACIÓN

• Preparación de las células para su conservación
• Composición del medio de la suspensión y adecuada
  densidad óptica
• El medio de la suspensión deberá proteger la
  viabilidad de las células. Usar el crioprotector
  adecuado en cada caso.
• Glucosa 7,5 para Anaerobios
• Glucosa 15 para Levaduras.
• Glutámico 0,67M para Bacterias Lácticas.
• Inositol 5 para Bacterias.
• Leche descremada para Levaduras, Hongos y
  Actinomicetos.
• Tipos de ampollas,tubos y viales para la
  liofilización.
• Dependerán del equipo del que se disponga o del
  tipo de muestra a liofilizar.
• Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o
  borosilicato, porque por su elevada resistencia
  ofrecerán muchas dificultad en su apertura.

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FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN POR EL
PROCESO DE LIOFILIZACIÓN

• -Temperatura durante la sublimación.
• Debe ser lo más baja posible, sin subir por
  encima de 50ºC.
• Grado de deshidratación alcanzado.
• Lo más alto posible.
• -Atmósfera de oxígeno en el tubo.
• Las células liofilizadas se guardan en tubos al
  vacío para evitar
• Rehidratación o presencia de gases (como el
  oxígeno) que pueden
• dañar las células.
• -Condiciones de almacenamiento.
• La temperatura debe ser constante a 18ºC y sin
  bajar de los 0ºC
• y, en oscuridad

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LIOFILIZACIÓN

• VENTAJAS
• -Reducción de la variabilidad del microorganismo.
• -Largo tiempo de conservación.
• -Aplicabilidad para la producción y distribución
  de los lotes

• DESVENTAJAS
• -El alto coste inicial del equipo.
• -La preparación de forma incorrecta de los
  distintos lotes puede desembocar en un
  estancamiento de la viabilidad y/o en pérdidas en
  la estabilidad de los caracteres de los
  microorganismos

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La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo
  plazo
• Conservación por congelación
• Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
• Conservación por transferencia periódica
• Conservación por suspensión en agua destilada o
  en agua de mar esteril

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Conservación por transferencia periódica

• Es un método en el que los organismos
  permanecen activos durante el proceso. Consiste
  en la inoculación de microorganismos en un medio
  de cultivo adecuado,la incubaión a una Tª
  adecuada para obtener crecimiento y finalmente el
  almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas.
  El proceso es repetido a intervalos que
  garanticen la obtención de un cultivo fresco
  antes de la pérdida del viejo.

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PARA UNA BUENA RESIEMBRA PERIÓDICA

• Medio de cultivo.
• Temperatura, tiempo y condiciones de incubación.
• Intervalo entre dos resiembras
• Reducción de la temperatura de almacenamiento.
• Medios no enriquecidos,con limitación de
  nutrientes.
• Restricción de la accesibilidad de aire del
  cultivo.

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La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo
  plazo
• Conservación por congelación
• Conservación por liofilización
• Métodos Alternativos
• Conservación por transferencia periódica
• Conservación por suspensión en agua destilada o
  en agua de mar esteril

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Conservación por suspensión en agua destilada o
en agua de mar esteril
Es un método alternativo muy usado y que da altos
porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto hongos filamentosos como
en levaduras y algunas bacterias. Consiste en
Suspender en agua esteril unas cuantas células
del cultivo que se quiere conservar. Para los
hongos filamentosos que no esporulan, se puede
poner en suspensión trocitos de agar con el
crecimiento del Hongo. En el caso de
microorganismos marinos, la suspensión se hace
en agua de mar diluida.
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La conservación de cepas microbianas

• Métodos Restringidos
• Desecación en papel de filtro
• Desecación en suelos,arena silicagel,etc
• Desecación en bolitas de alginato
• Desecación en sal gorda para halobacterias

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Papel de filtro
Métodos de desecación
Paquete cerrado
Paquetes semicerrado
Papel Watman nº4
15 minutos 121ºC
Desecador
Papel con cultivo
2-3 semanas 4ºC
Cultivo
Suspensión celular
Cerrado de Los paquetes
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Suelo
Métodos de desecación
G E R M I N A C I Ó N
20 minutos 121ºC
Tierra esteril 4ºC
Microorganismos en fase durmiente
4-5días 25ºC
Agotamiento de nutrientes
Almacenamiento a 18ºC
Cultivo esporulado
Suspensión de esporas
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Bolas de Alginato
Métodos de desecación
Gotas
Placa petri con Papel secante
Alginato 3 13 minutos 121ºC
CaCl2 0,03M esteril
Medio de Cultivo 0,75M Sacarosa 48horas
Gotas de alginato con cultivo
DESECACIÓN
Gotas de alginato con cultivo 30
minutos
Corriente de aire estéril ó bomba de vacío
a Temperatura controlada Pérdida del 30 del peso
Cultivo
Suspensión en agua esteril
Polimerización del Alginato