Prйsentation PowerPoint

1
Xénobiotiques Substances étrangères à
l'organisme de faible poids moléculaire
Médicaments polluants aliments
Exposition inévitable
2
Métabolisme des xénobiotiques
X
Monooxygénases P450
Ex GST
Ex MRP
3
Grande variété de substrats inconnus a
priori bcp réactions bcp denzymes bcp
substrats bcp disoformes
4
Nomenclature des Cytochromes P450
CYPs impliqués dans le métabolisme des
xénobiotiques
Familles (de 40 de similitudes)
1 2
3
Sous-familles ( de 55 de similitudes)
A B A B C
D E J A
CYPs humains
1A1, 1B1 2A6 2B6 2C8, 2C9 2D 6
2E1 2J2 3A4 1A2 2A7 2B7
2C18, 2C19 2J4 3A5
2A13 3A7
3A43
CYPs soulignés polymorphisme génétique
en rouge principaux CYPs hépatiques humains une
nomenclature détaillée et mise à jour peut être
consultée sur le site internet
http//drnelson.utmem.edu 57 CYPs chez lhomme
5
Spécificité Relative et Chevauchante
6
Expression tissulaire des EMX
Foie
Les tissus tumoraux expriment des EMX
différents en quantité et en qualité
Autres tissus Peau, intestin, poumon,
rein Lymphocytes, cerveau, nez. mais
Le métabolisme peut être qualitativement
important par la nature des métabolites
produits, toxiques, actifs.
7
Les enzymes de phase II
Transférases, T X-OH R-OH ---gt XOR, très
hydrophile ou moins réactif R Enzyme donneur
Ac. Glucuronique Glucosyl T
(UGT) UDPGA Glutathion Glutathion-S-T
(GST) GSH Acétyl N-acétyl T (NAT) Acétyl
CoA Méthyl Methyl T (MT) SAM Sulfate Sulfo
T (ST) PAPS
Nombreuses isoformes, superfamilles d enzymes
8
XOR
Phase III
X
X
Sang
Cellule
X---gt XOH---gt XOR
X
X
Bile Lumière intestinale Tubules rénaux Tissus
XOR
MDRgt pGP MRP gt 1 à 7 conjugués aussi
substances endogènes hydrophiles chargées
9
Le transporteur mdr (P-gp, ABCB1) affecte la
distribution des médicaments dans l organisme
Excrétion fécale
Absorption orale
Intestin
I.V.
Espace vasculaire
Excrétion uninaire
Espace intersticiel
10
Xénobiotique
Métabolisme et Transport EMTX
Organi sme
Facteurs environnementaux physiopath
Facteurs génétiques
Cible
Réaction de lorganisme
réponse
Pharmacologique
Toxicologique
11
Variabilité du CYP2C8
range 2 to 35
Human Liver microsomes
12
P450 1A2 Humain
.
pmoles P450 1A2/mg
human liver
13
CYP1A2 dans les microsomes de foie humains
.
nb individuals
pmoles 1A2 / mg protéin
14
Comparison of CYP1A2 indexes (AFMU1X1U)/17U
Population
1 (n) Population 2 (n) p Value
Mean SD
Mean SD Smoking status
Smokers (164) Non-smokers (81)
0.0001
6.963.41 4.07 1.79 OC use in
women Not using OC (130) OC users
(53) 0.0005t
6.153.38
4.342.36 Sex
Males (n62) Women(n183)
0.0006t
7.23 2.9 5.63 3.23 Cigarette
flavor Blonde tobacco (87) Black tobacco
(48) 0.03t
6.54 2.86 8.15 3.59 Filter use
Filter (133) No
filter (31) 0.01 t
6.58 3.14 8.55
4.08 Smoking behaviour Inhalation (127)
No inhalation (36) 0.6
7.123.68
6.382.23
Catteau et al. 1995
15
The Early History of Pharmacogenetics

• 1932 First Inherited Difference in an Inherited
  Response to a Chemical Inability to Taste
  Phenylthiourea.
• World War II Hemolysis in African-American
  soldiers treated with primaquine.
• 1957 inheritance might explain many individual
  differences in the efficacy of drugs and in the
  occurrence of adverse drug reactions Motulsky.
• 1959 Pharmacogenetics the Role of Genetics in
  Drug Response. Friedrich Vogel .
• 1959 Genetic influence on isoniazid blood
  concentrations
• 1964 Genetic variation in ethanol metabolism
• 1977 CYP2D6 polymorphism
• Daprès Flockhardt 2002 Hippocrate notion de
  terrain

16
Substrats pharmacogénétique
Débrisoquine
N C NH NH2
CYP ???
OH
4-OH-Débrisoquine
N C NH NH2
Spartéine même type de résultats
17
Daprès Maghoub et al. 1977
95
Nombre dindividus
5
Log, rapport métabolique, MR
18
.
.
.
.
metaboliseurs
rapides
metaboliseurs
Nombre d individus
ultra-rapides
metaboliseurs
lents
12.6
( )n
10
0.1
1
100
Log Debrisoquine / 4OH debrisoquine RM
Bertilsson and Dahl 1996
19
Polymorphismes génétiques bases moléculaires
Pas de gène actif lents
1 gène actif Rapides ou intermédiaires
2 gènes actifs rapides
Plus de 2 gènes actifs ultrarapides
20
CYP ALLELES
From http//www.imm.ki.se/CYPalleles/
21
Déficits génétiques en enzymes du métabolisme
des xénobiotiques
CYP 1A1(induction 10) CYP 2A6 (5) CYP 2C9
(3) CYP 2C18 (?) CYP 2C19(5-20) CYP 2D6
(5-7) CYP 2E1(gt1) CYP3A4/5 (?)
GSTM1 (50) GSTT1 (10-20) GSTP1 (10) UGT1A1
(5-10) NAT2 (50) EH (lt5) TPMT(lt1)
gènes pour lesquels une duplication est connue
Les fréquences varient selon les populations
ethnopharmacogénétique
22
Phénotype - activité réelle - quantifiable -
mise en oeuvre plus difficile - variations
(xénobiotiques, pathologies) - pas permanent
Génotype - facile - permanent - pas
quantifiable - pas activité réelle
23
GENOTYPAGE outils
Méthodes fondées sur la PCR RFLP, PCR
allèle-spécifique, OLA .. (spécifiques)
séquençage Méthodes non spécifiques SSCP,
DGGE D-HPLC gt détection
de nouveaux polymorphismes  Carte génétique 
puces à ADN

24
(No Transcript)
25
Oligonucleotide array for cytochrome P450
genotesting
From Flockhart DA and Webb DJ. Lancet End of
Year Review for Clinical Pharmacology, 1998.
26
Conséquences cliniques ??
ou
27
Public health issue
First cause of iatrogenic drug accident
400 000 à 580 000 treated patients
17 000 hospitalisations / year
3000 death / year
28
VARIABILITE DANS LA REPONSE
Nb de patients
Doses de warfarine (mg/semaine)
Observance du traitement Alimentation (vit.
K) Situation physiopathologique Interactions
médicamenteuses Facteurs génétiques
Risque hémorragique
Risque thrombotique
HYPERSENSIBILITE
RESISTANCE
29
INTERACTION METABOLISME/CIBLE PHARMACOLOGIQUE
AVK
VKOR Vitamine K époxyde réductase
VKOR
CYP2C9
VIT K réduite
VIT K oxydée
?GC?glutamyl carboxylase
?GC
Facteurs Vit K dépendant inactifs
Facteurs Vit K dépendant actifs
30
HYPOTHESE DU TRAVAIL Les facteurs génétiques
liés au métabolisme et à la cible
pharmacologique influencent la réponse aux
AVK
À partir dune étude chez des volontaires sains
(n230) recevant une dose unique
dacénocoumarol détermination de la part
génétique dans la variabilité de la réponse
pharmacologique
Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent
Becquemont
31
PHARMACOGENETIQUE DES ANTICOAGULANTS ORAUX
Identification des gènes (bibliographie)
Médicament
Recherche de polymorphismes (SNP) (criblage,
base de données)
CYP 2C9
Métabolisme
Analyse du promoteur et des régions codantes
VKORC1
Cible
Conséquences fonctionnelles
Activité transcriptionnelle et de la protéine
mutante
Analyse par SNP et haplotype
Réponse
Corrélation avec la réponse
Mesure du Facteur VII Part de la variabilité
génétique
32
RESULTATS CYP 2C9 (région codante)
Effets des allèles CYP 2C92 et 3 sur la réponse
à lacénocoumarol (ratio facteur VII J0/J24
x100 )
Répartition des génotypes
Plt 0.001
CYP 2C9 3
CYP 2C9 2
14 de la variabilité
NS
33
ANALYSE DE LA REGION 5 FLANQUANTE DU GENE CYP 2C9
Identification de nouvelles mutations par HPLC
dénaturante, puis séquençage direct des 230
Caucasiens
Variation facteur VII - 20 (plt10-4)
5
3
T-640 0,005
G-1538A 0,085
G-620T 0,138
G-982A 0,086
G-1097A 0,136
T-1189C 0,398
NS
Clin Pharm Ther 2004
34
ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMES DU GENE
VKORC1 EN RELATION AVEC LA REPONSE PHARMACOLOGIQUE
Base de données gt SNPs reconstruction des
haplotypes corrélation avec variation du
facteur VII
7 haplotypes SNP -1639GgtA  marqueur des
haplotypes 
35
EFFET DE LA MUTATION VKORC1 1639GgtA SUR LA
REPONSE A LACENOCOUMAROL
Plt0.001
Variation Facteur VII
Génotype VKORC1
37 de la variabilité
36
EFFET ADDITIF DE VKORC1 1639GgtA ET CYP2C93 SUR
LA REPONSE A LACENOCOUMAROL
Variation Facteur VII ()
37
CONCLUSION
Variabilité dans la réponse pharmacologique de
lacénocoumarol
POIDS
CYP2C9
4
14
INCONNUE
37
VKORC1
CYP2C93 VKORC1 G-1639A 50 de la variabilité
38
(No Transcript)
39
Oméprazole and CYP2C19
40
(No Transcript)
41
Xenobiotic
Drug
Exposure
Metabolism Transport Activation
Metabolites
Metabolites
XMTE
normal cell DNA adducts, mitogenic signal
normal cell
Tumor
Xenogenetics
Pharmacogenetics
Response
42
EXEMPLE DE LA THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE
(TPMT)
43
ACTIVITE TPMT DISTRIBUTION TRIMODALE
Wt/Wt
M/Wt
M/M
44
POLYMORPHISME DE LA TPMT
? Structure du gène
Répartition des allèles variants
? Principales mutations

7 78 lt 1 5



45
(No Transcript)
46
Sans Génotypage
Avec Génotypage
fréquence
coût C
coût total
coût C
coût total C
Génotype
/
0,89
710
632
710
632
/-
0,11
710
78
0
0
-/-
0,003
7757
23
0
0
Génotypage
1
0
0
100
100
733
732
COÛT TOTAL C
47
Sans génotypage Avec génotypage
myelotoxicité
fréquence
coût C
coût total
coût
coût total
Génotype
/
non
0,89
710
631,9
710
631,9
/-
non
0,110,70
710
54,7
0
/-
oui
0,110,30
7757
256
0
-/-
oui
0,03
7757
23,7
0
Génotypage
0
0
0
100
100
967,1
731,9
Coût total
Coût du génotypage, incluant, le traitement
(aza), le
traitement de la myélotoxicité, le génotypage.
30 des hétérozygotes sont susceptibles de
développer
une myélotoxicité.
Biologie coût 100 / patient Gain total
235 / patient
48
Irinotecan (CPT-11) Toxicity Prfediction
Gene UGT1A1
49
Pharmacokinetics Parameters of lrinotecan and
polymorphisms in UGT1A1 promoter
20 pts treated with CPT11 (phase 1)
Genotype and SN38G/SN38 ratio
Iyer, Pharmacogenomics J 2002
50
Neutropenia (5FU / Irinotecan) and UGT1A1 genotype
N 76 patients (HEGP)
no severe neutropenia

(6/8)
6/6
p 0,001
6/7
Neutropenia Grade 3/4
(8/39)
(4/29)
p 0,0001
7/7
Nb of cures
toxic death in a pt with a 7/7 génotype
Nb of cures median (7/7) 4
51
Toxicity of 5-FU / Irinotecan association and
promoter polymorphisms in the thymidylate
synthase gene (TS)

(4/11)
p 0,02
(5/33)
(0/19)
Génotype TS
Lecomte, Clin Cancer Res 2004
52
Xenobiotic
Drug
Exposure
Metabolism Transport Activation
Metabolites
Metabolites
XMTE
normal cell DNA adducts, mitogenic signal
normal cell
Tumor
Xenogenetics
Pharmacogenetics
Response
53
Réponse à la chimiothérapie des cancers ORL

• 68 des malades ont une tumeur mutée pour p53.
• 87 des non répondeurs et 57 des répondeurs
  p(lt0,003) ont une altération de p53.

54
Réponse à la chimothérapie des cancers ORL
Régression logistique
Cabelguenne et coll.
55
(No Transcript)
56
(No Transcript)
57
(No Transcript)
58
(No Transcript)
59
Clinical Applications
Anticancer drugs 5FU, Irinotecan, Oxaliplatine
Immunosuppressors azathioprine,
ciclosporine, tacrolimus
UGT1A1 DPD TS GST
Pharmacogenetics Molecular oncology Clinical
chemistry HEGP
TPMT CYP3A4/5 MDR-1
Anticoagulants warfarine, acenocoumarol
Psychotropes
CYP2D6
CYP2C9
60
INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE
Les variations du métabolisme /transport ont
des conséquences - pharmacocinétiques -
pharmacodynamiques - toxiques Le rôle du
métabolisme / transport est important quand -
la fenêtre thérapeutique est étroite -
lefficacité est difficile à évaluer
rapidement Il est possible de prédire la
capacité métabolique - génotypage - phénotypage
61
(No Transcript)
62
(No Transcript)
63
De lexposition au cancer
Détoxification Elimination
Exposition
Métabolisme
Adduits
Promotion
Progression
Cancer
Réparation
64
Xénobiotic
Exposure
Activation/détoxication
XMTE
réactive Métabolite
Elimination
DNA
DNA-adduct
Répair
Exposure metabolism
Mutation
molecular signature
escape
Cancer
65
Lung Cancer
Exposure
Benzo(a)Pyrene (BaP)
CYP1A1 (AhR induction)
EH /
EH
7,8 époxide BaP
Metabolism
UGT
7,8 diol BaP
CYP1A1 (AhR induction)
Diolepoxide (BPDE
GSTM1,P1 EH?
in vivo, in vitro p53 173, 248, 273
DNA Adducts (BPDE-G)
Repair
in vivo, p53 173, 248, 273
Mutation
Escape
Cancer
66
Smokers light
intermediate heavy Total GST
1.0 6.0 13 GST-
1.8 8.0
15 AdénoK GST 1.0
2.0 12
GST- 2.0 4.0
14 Small cell GST 1.0
3.0 8.0
GST- 2.0 8.0
12
Stucker et coll. 1996
67
Odds Ratio in lung cancer as a function of -
inducibility of CYP 1A1 - GST M1
Stücker et coll.
68
Rô
l
e
d
e
l
a
GS
T P1
d
an
s l
e
r
isq
u
e
d
e
ca
n
ce
r
d
u
p
ou
m
on
S
u
jet
s
C
o
n
tr
ô
l
e
C
a
n
c
er
O
R
P
e
tit
es
O
R
P
o
um
o
n
c
e
l
lul
es
G
S
T
P
1
AA

9
2
,
4
8
8
8
3
,
3
A
G
G
G
7
,
6
1
2
2
1
6
.
7
3
,
6
(
1
-4,
1
)
(
1
,3-
9
,
8
)
Loriot et coll.
69
Lung Cancer
Exposure
Benzo(a)Pyrene (BaP)
CYP1A1 (AhR induction)
EH /
EH
7,8 époxide BaP
Metabolism
UGT
7,8 diol BaP
CYP1A1 (AhR induction)
Diolepoxide (BPDE
GSTM1,P1 EH?
in vivo, in vitro p53 173, 248, 273
DNA Adducts (BPDE-G)
Repair
in vivo, p53 173, 248, 273
Mutation
Escape
Cancer
70
Certaines substances peuvent faire varier
lexpression des EMX et en particulier des
CYPs.
- Modification de lactivité quantité denzyme
constante, activité variable activation,
inhibition - Modification de
lenzyme Quantitative induction,
répression Qualitative modification
post-traductionnelle
71
Induction augmente métabolisme, diminue
concentration - inductibilité variable -
conséquence dépend des médicaments - autres
effets PGP, absorption.....
Inhibition diminue métabolisme augmente
concentration - dépend des affinités et des
concentration (I/Ki) - dépend des
xénobiuotiques, médicaments - spécificité en
fonction de la concentration (I/Ki)
72
Inducteurs de cytochromes P450
Certains dentre eux induisent dautres EMX, UGT,
GST
73
ADN
Transcription RUN-ON
ARN
Maturation
ARNm
Analyse ARN
ARNm
ARN stabilité
traduction traduction in vitro
Protéine
Degradation
Analyse protèique activité immunologie modificatio
n PT
Post-traduction
stabilité protéique
Protéine
74
inducteur

noyau
transcription
cellule
75
Les récepteurs impliqués dans linduction
Dioxine, HAP AhR ARNT AhRR? CYP1A1
Variabilité dans induction Barbituriques
CAR CYP2B6 Rifampicine PXR,
SXR (GR) CYP3A4
76
Mécanismes dinduction
- à tous les niveaux transcriptionnel, post
transcriptionnel, traductionnel et post
traductionnel
X
X
1-25 OHD3
X, AG
GR
VDR
PPAR
PXR
CAR
AhR
Transcription de CYPs 1A1, 1A2, UGT, GST, AlDH
Transcription de CYPs 4A
Transcription de CYPs 3A4, 2B6, 2C9, 2C19, mdr
77
Métabolisme de la vitamine D
CYP3A4
CYP2D6?
78
Métabolisme de lacide arachidonique
79
CYP3A4
CYP2D6
LXR
CYP3A4
CYP2D6
FXR PXR
80
Cholestérol
CYP7A, 8B 3A, 2D6 ?
SHP
FXR
PXR
Acides Biliaires
OATP2 CYP3A
BSEP
ABOHu
ABbil
81
Interactions récepteurs/endobiotiques/xénobiotique
s
Néo G ß-oxydation tumorigenèse
CYP UGT ALDH
CAR
-

CAR
LXR
Cholestérol
CYP7A
FXR PXR
CAR
Stéroïdes
AB
Élimination (CYP,UGT,ST)
82
Autres mécanismes impliqués dans linduction
- stabilisation de la protéine CYP2E1/éthanol -
déstabilisation du méssager insuline/CYP2E et
2B - stabilisation du messager CYP1A2 et HAP -
modification post-traductionnelles
(phophorylations CYP2E)
83
Inhibition des EMX
inhibition réversible (cimétidine) et
irreversible (TAO, Gestodène) médicaments
/substratsgt interactions médicamenteuses,
aliments Constantes d affinité Km/Ki à
manipuler avec précautions exemples CYP
3A4 Ketoconazole, ritonavir, jus de
pamplemousse CYP1A2 fluvoxamine,
furafylline CYP 2C9 sulfaphenazole CYP2C19 ome
prazole CYP2D6 quinidine, paroxétine CYP2E1 di
sulfiram
84
v Vm S Km S (1 I/Ki)
Med1(S) Met 1
Km
CYP3A4
Ki
Med2 (I) Met 2
85
Inhibiteurs des CYPs
! Ki et concentration tissulaire réversible et
Irréversible spécifique
86
Conséquences de linduction ou de linhibition
Modification de la production de métabolites
Toxicité production métabolite toxique
Effets exagérés accumulation du produit
inéfficacité élimination trop rapide, pas de
production de métabolite actif ! Absorption
aussi entre en ligne de compte (MDR)
87
Phénotype - activité réelle - quantifiable -
mise en oeuvre plus difficile - variations
(xénobiotiques, pathologies) - pas permanent
Génotype - facile - permanent - pas
quantifiable - pas activité réelle
88
Phénotypage in vivo
CYP 1A1 induction lymphocytes EROD CYP 1A2
caféine sang PX/C (NAT2) CYP 2A6
Coumarine CYP 2C9 Diclofenac CYP 2C19
Méphénytoïne, Proguanil, Oméprazole CYP 2D6
Debrisoquine, Spartéine, Dextromethorphane
CYP 2E1 Chlorzoxasone CYP 3A4
6-ß-OH-Cortisol (induction), 13, 14
(C)Erythromycine, Midazolam,
Dapsone, Dextromethorphane
89
Polymorphismes génétiques
enzyme phénotype génotype GST
M1 50 oui act. oui GST T1 30 oui
act. oui GSTP1 20 non oui NAT1 ? oui
test oui NAT2 50 caféine oui EH oui
act. oui TPMT 0,5 oui act. oui MT ST
90
Polymorphismes génétiques
enzyme phénotype génotype CYP
1A1 lt1 induction oui CYP 1B1 lt1 non oui 2
A6 coumarine oui 2C9 diclofenac oui 2C
18 ? ? oui 2C19 5 Meph, omé,
pro oui 2D6 5 Debris,Dextro, Spart
oui 2E1 lt1 Chlorzoxasone oui 3A5 20 ? ?

91
GENOTYPAGE outils
Méthodes fondées sur la PCR RFLP, PCR
allèle-spécifique, OLA .. (spécifiques)
séquençage Méthodes non spécifiques SSCP,
DGGE D-HPLC gt détection
de nouveaux polymorphismes  Carte génétique 
puces à ADN

92
(No Transcript)
93
But prédire métabolisme dun médicament
administré à un patient
Questions - Quels sont les métabolites produits
? - Quels sont le ou les enzymes responsable(s)
de la production de ces métabolites ? -
Quelles sont les conséquences in vivo du
métabolisme - efficacité, toxicité,
interactions médicamenteuses - Quelle est la
variabilité individuelle de la réponse due au
métabolisme (induction, pharmacogénétique)?
94
Early in drug development Small quantities
of product Qualitative, quantitative ? In
man
95
Outils - animaux entiers,
humanisés - tranches, - cellules (hépatocytes,
lignées) - fractions sub-cellulaires - enzymes
purs (purification, enzymes recombinants) -
sondes, anticorps - modèles moléculaires
cellulaire
moléculaire
96
Enzymes purs - Activité (métabolites) -
production de métabolites - constantes
cinétiques Km, Vm, Ki - effets in situ des
métabolites
- effets de lexpression des CYP -
mutagenèse - production danticorps
quantité CYP immuno-histochimie
immuno-inhibition
97
Human liver 1 Hepatocytes, slices -
metabolites, conjugation - toxicity - induction
--gt drug interactions - difficult to obtain -
reproducibility
98
Human liver 2 hepatocytes - long time in
culture (up to 1 month) - 1 cell type -
transport (doublet) - no cell-cell interaction
99
Human liver 3 slices - easy handling -
cell-cell interactions - other organs
(kidney) - histochemistry - short-term culture
(72 h.) - high oxygenation (necrosis)
100
Induction in human slices and hepatocytes of CYPs
by CPA and PB
H
CYP 2B6 mRNA
S
CYP 2B6 protein
H
S
C CPA C CPA C PB CPA Std
24h 48h 72h
H
CYP 3A4 mRNA
S
CYP 3A4 protein
H
S
C CPA C CPA C PB CPA
Std 24h 48h
72h
H. Martin, V. Albaladejo, I. de Waziers,
Aventis, U490
101
Induction in human slices and hepatocytes of
CYP2B6 by CPA and PB
mRNA
Protein
Activity
Hepatocytes
CPA
PB
Slices
102
Human liver 4 Sub cellular fractions -
microsomes (CYPs, EH, UGT) - cytosol (ST, NAT,
GST) - S 9000 (S 9) both ER and cytosol
103
Human liver microsomes contain all hepatic
CYPs variability
104
Human liver microsomes Enzyme(s) responsible
for the production of a metabolite -
correlations quantity of enzymes/ activity -
immunoinhibition - represent whole human
liver Enzyme kinetics VM, KM ! Drug
interactions inhibition / activation -
reversible / irreversible - Ki ---gt prediction
in vivo ??? Use in association with
recombinant enzymes
105
Cell lines Hepatomas, other origins
Expression of XME and particularly CYPs low
---gt cannot be used directly for drug
metabolism Induction, mechanisms with or
without transfection Can be used as support
for transfection - CYPs ---gt in situ effect of
metabolism - Transcription factors --gt CYP
expression
106
Pure enzymes Purification Recombinant
enzymes
107
Commercialement disponibles
108
Pure enzymes 2 - Activity (metabolites) -
Metabolite production - Kinetics constant
Km, Vm, Ki - in situ effects of metabolites
- effects of CYP expression - mutagenesis -
Antibody production CYP quantity
immuno-histochemistry immunoinhibition
109
CYP 2B6 EXPRESSION IN EXTRAHEPATIC TISSUES
Adipocyte
Putamen
Placenta
Lung
Intestine
Colon
Kidney
liver
CYP 2B6
CYP2B6 is expressed in liver, lung, kidney,
intestine and brain
110
(No Transcript)
111
Med -------gt med stratégie générale
E?
- mise au point analytique, dosage conditions -
production générale (animaux, hépatocytes,
tranches) - microsomes, constantes cinétiques,
corrélations - inhibiteurs chimiques
anticorps - enzymes purs ( prise en compte de
leur quantité relative) - modèles moléculaires
112
Prédiction des métabolites - système de
métabolisation (animaux , tranches,
hépatocytes) - système analytique performant (
HPLC, SM, RMN, radioactivité) Prédiction
des enzymes - stratégie maintenant bine mise au
point, courante dans les laboratoires
académiques et industriels.
113
In vitro Metabolism of proguanil
5
4
3
V (pmol/mg/min)
2
1
Enzyme high affinity
low affinity
0
0
10
20
30
40
V/S
Becquemont et al. J. Pharm. Exp. Therap 1997
114
Influence of substrate concentrations used in
vitro
5
V pmol / min / mg prot.
4
3
2
1
CYP 3A4 10 to 20
20 to 30
30 to 50
0
1000
100
10
1
,1
PROGUANIL µM
115
In vitro Metabolism of proguanil
116
In vitro Metabolism of proguanil (recombinant
CYP2C19)
Km 37 7 µM Vm 0.47 0.03
V (picomoles/min/picomoles CYP2C19)
proguanil (µM)
117
Interaction proguanil - omeprazole
0.015
62 dinhibition
0.01
no inhibitor
V
omeprazole
0.005
0
1
10
100
1000
proguanil
118
In vivo interaction proguanil-omeprazole in human
65 dinhibition
40
30
Partial metab clearance
20
prog/cyclo l/h
10
0
proguanil
placebo
119
N-desmethyl clomipramine
Human liver microsomes Vm 73 nmol/h/mg
microsomal protein Km 75 µM At 10 µM v Vm x
S Km S 73 x 10 8.6 nmol/h/mg
75 10
Yeasts The concentration of each CYP
is important v rate at 10 µM Clo for each
CYP c hepatic concentration of each CYP v x
c pmol/h./mg 1A1 lt10 1A2 12 2C8 155 2C9 2000 2C18
1600 2C19 1450 2D6 1160 3A4 6400 Total 12777 12.8n
mol/h/mg
K. Kramer-Nielsen and K. Brosen
120
Procainamide métabolism (N-hydroxylation)
121
Human liver and recombinant enzymes -
metabolites, enzymes - kinetics constant -
qualitative prediction in vivo - quantitative
prediction in vivo hepatic concentration of
the drug hepatic concentration of enzymes -
drug interactions - drug efficacy and toxicity
122
In silico prediction, molecular models - few
models - Substrate, protein - substrate
specificity - mutations effects -
mutagenesis - epitope autoantibodies
123
CYP2D6
de Groot and Vermeulen 1996
124
A, two views depicting the structure of
flurbiprofen complexed with 2C9dH
Wester, M. R. et al. J. Biol. Chem.
200427935630-35637
125
A, two views of the secondary and tertiary
structure of 3A4
Yano, J. K. et al. J. Biol. Chem.
200427938091-38094
126
Structure of CYP2C8 and the fatty acid binding
site at the dimerization interface
Schoch, G. A. et al. J. Biol. Chem.
20042799497-9503
127
(No Transcript)
128
Conclusions - Tools are available to predict
drug metabolism in vivo from in vitro data -
qualitative, quantitative - analytical
methods - drug interactions (inhibition,
induction) - drug, enzyme concentration -
mechanistic studies - in silico.