Biologie du dveloppement: Embryologie exprimentale

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Biologie du développementEmbryologie
expérimentale

• Christophe MagnanProfesseur Université Paris 7
• magnanparis7_at_free.fr

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Un bouquinpas mal, et je ne connais pas lauteur
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Commençons par le début oeuf non fécondé
Est déjà orientable On définit Un pôle animal
(région pigmentée) PA Un pôle végétatif (région
non pigmentée) PV Donc un axe animal /
végétatif futur axe antéro-postérieur Cest
dingue
Pôle animal
Pôle végétatif
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uf non fécondéDistributionhétérogènedes
constituants
PA
Gradient De vitellin
Gradient DARNm
Pour les ARNm Gradient quantitatif Et gradient
qualitatif Certains ARNm seront plutôt localisés
du côté dorsal dautres du côté ventral
PV
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Principales étapes du développement

• La segmentation
• permet de passer du stade unicellulaire (uf) au
  stade multi(pluri)cellulaires
• Les premières divisions aboutissent à la
  formation de la morula. A la fin de la
  segmentation, lembryon est au stade blastula.

La blastulation - mise en place du blastocèle
(une cavité)
La gastrulation - contribue à la mise en place
des 3 feuillets fondamentaux

• La neurulation
• mise en place dun tube creux (tube neural) dans
  la région dorsale
• Début du modelage de lembryon, allongement selon
  laxe antéro-postérieur et applatissement selon
  laxe dorso-ventral.

Les cellules sont appelées blastomères Les
blastomères du pôle animal sont plus petits (
micromères) que ceux du pôle végétatif (
macromères)
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A la fin de la segmentation se forme la blastula

• La blastula est creusée dune cavité, le
  blastocèle, plutôt du côté PA

Pôle animal
Blastocèle
Pôle végétatif
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• Gastrulationmise en place des 3 feuillets
  (couches de cellules) fondamentaux qui donneront
  tous les organes
• Ectoderme (et Neurectoderme)
• Mesoderme
• Endoderme

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Pour mettre en évidence la mise en place des 3
feuillets (et les mouvements de la gastrulation)
Technique des marques colorées
Coloration de quelques cellules dans des régions
dintérêt. On repère à différents stades les
cellules qui portent la coloration (coupes
histologiques, observation au microscope)
Visitez le site http//www.snv.jussieu.fr
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Après la neurulation, le plan dorganisation
primaire est réalisé et est commun à tous les
vertébrés

• Les 3 feuillets sont en place
• Externe (ectoderme)
• Moyen (mésoderme)
• Interne (endoderme)
• Les 3 axes sont en place
• Antéro-postérieur
• Dorso-ventral
• Médiolatéral

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Technique des marques colorées permet de définir
la carte des territoires présomptifs
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Lors de la fécondation une région apparaît le
croissant gris
uf non fécondé
uf fécondé
Impact spermatique
Rotation corticale de 30
Pôle animal
Pôle végétatif
Croissant gris (ou dépigmenté) apparaît à la
suite de la rotation corticale... Dépigmentation
superficielle Le cytoplasme superficiel bascule,
le cytoplasme profond reste immobile.
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Le croissant gris est-il important ? Tout a
commencé en 1903
Idée Séparation des cellules au stade 2
blastomères
Vue de face
Vue latérale
Hans Spemann
2- Embryon ventralisant même sans croissant gris
ébauche ventrale
2 embryons normax
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Analyse moléculaire

• Comprendre la succession des évènements
• Pourquoi le dos apparaît ?
• Pourquoi le ventre apparaît ?

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Expériences de Dale et Slack (1987)
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Régionalisation de linduction.
Visitez le site http//www.snv.jussieu.fr
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Visitez le site http//www.snv.jussieu.fr
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• Au stade blastula, les cellules de la zone
  marginale ont déjà recu une info
• Pour les orienter vers une différenciation en
• chorde (mésoderme dorsal)
• cellules musculaires (mésoderme intermédiaire)
• cellules sanguines (mésoderme ventral)

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En résuméA léchelon moléculaire

• Des cellules inductrices envoient une
  information Elle synthétisent et sécrètent une
  molécule par exemple
• Blastomères végétatifs envoient une info vers des
  micromères de la zone marginale Induction du
  mésoderme (dont la chorde)
• Des cellules compétentes sont capables de
  recevoir linformation et de linterpréter Elles
  possèdent des récepteurs et des messagers
  intracellulaires capables dagir au niveau
  génomique

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Dès 1924

• Région très importante La chorde (corde, ex
  lèvre dorsale du blastopore , mésoderme
  chordale)
• Expérience Greffe de la chorde dans la région
  ventrale dune jeune blastula(Hans Speman,
  Hilde Mangold)

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Comment se fait la dorsalisation ?

• Quelques techniques dapproches

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Les stratégies1- quantifier les ARN (Northern
Blot)

• On prélève le tissu dintérêt et on extrait les
  ARN (totaux)
• On fait migrer les ARN sur un gel
  delectrophorèse
• On transfert les ARN sur une membrane de
  nitrocellulose
• On dépose sur la membrane une sonde radioactive
  (spécifique de lARN quon recherche)
• On révèle par autoradiographie

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2- Quantifier les protéines (Western Blot)

• Même principe que pour les ARN
• On prélève, on extrait, on fait migrer , on
  transfert sur nitrocellulose, on hybride avec un
  anticorps (radioactif ou couplé à une molécule
  qui peut colorer un substrat

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Point de départ on a remonté le chemin à
lenvers
techniques dimmunofluorescence Début de
Gastrulation On a identifié une protéine
Blastocèle
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En présence de Wnt8 il y a plus dARNm de
caténine (par augmentation de la trnascription
et/ou diminution de la dégradation)
Xwnt-8 est un candidat pour induire la synthèse
de ß-caténine
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In vivo (sur lembryon entier), autre effet de
Xwnt-8

• On incube les embryons avec ou sans Xwnt-8 et on
  observe ensuite où est localisée la caténine
  (technique dimmunohistochimie)

Quantité augmente Localisation nucléaire
Xwnt-8
Contrôle
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Petit rappel toujours une histoire de cellule
inductrice et compétente
Macromères (endoderme)
Xwnt-8
Xwnt-8
Xwnt-8
Microméres (zone marginale dorsalemésoderme)
ß-caténine
Signaux de dorsalisation
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Autres principaux partenaires de Xwnt-8

• Dishevelled (DSH ou DVL)
• Axin
• Glycogen-synthase kinase-3 (GSK3)
• Appartient à la famille des Sérine/thréonine
  kinase des enzymes qui phosphorylent dautres
  protéines sur des résidus acides aminés, sérine
  ou thréonine)
• Rôle de  docking  , séquestration
• GSK3 induit la dégradation de la ß-caténine

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Revenons à la rotation corticale
Impact spermatique
Rotation de 30
GSK3 ß caténine
GSK3 ß caténine
GSK3 ß caténine
GSK3 ß caténine
Xwnt-8
Xwnt-8
Xwnt-8, inhibe GSK3, ce qui permet à ß-cat dagir
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En résumé
Centre Ventral
Centre De Spemann
GSK3 ß caténine Xwnt-8
Nieuwkoop
Et la suite comment la ß-caténine agit pour
 dorsaliser  ? Quelle(s) cible(s) dans
lorganisateur de Spemann ?
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Toujours la même stratégie chercher un gène qui
ne sexprime que dans lorganisateur de Spemann

• Un bon candidat  Siamois 

B, C, D on a bloqué la transcription de Siamois
et on a injecté dans lembryon B ARNm de
Xwnt8 C ARNm de ß-caténine D ARNm de
Siamois E Embryon témoin
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Et quel est le rôle de Siamois ?
Piste 3 Effet de Siamois Mesure des ARNm Nog
Noggin Chd Chordin Synthèse stimulée sous effet
Siamois
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On trouve bien Chd, Nog et Siamois dans la future
région dorsale(mesure des ARNm par Northern Blot)
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Comment Chordin contribue à la dorsalisation (et
la neurulation)
En empêchant BMP4 dagir BMP4 (Bone
Morphogenesis Protein) protéine qui inhibe la
différentiation nerveuse et stimule la
différentiation en épiderme en agissant
conjointement avec dautres facteurs (FGF, IGF,
HGF)
BMP4 se lie à son récepteur (à activité Ser/thr
kinase) Phosphorylation de Smad1 qui peut agir
avec Smad4 pour inhiber les gènes de
différentiation nerveuse  Cest clair Quand
BMP4 est activé, pas de différenciation en tissu
nerveux, mais en épiderme Pas de dorsalisation,
mais ventralisation
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Comment chordin agit ?
Chordin (Chd) se lie à BMP4 par des résidus
cystéines (CR1, CR3 et CR4) Xlr est une protéine
régulatrice qui coupe chordin
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Résumé dorsalisation /neurulation
Niewkoop,
Xwnt-8
Récepteurs Frizzled, LRP5/6
BMP4
Ectoderme
Speman
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Rappels

• Comme toutes les protéines exportées (sécrétées),
  Xwnt-8 et BMP4
• Sont synthétisées dans le réseau reticulum/Golgi
• Possèdent au départ une séquence signal (qui est
  excisé dans le reticulum)

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Quelques gènes exprimés dans le centre ventral et
lorganisateur de Spemann
Rappels ARNm (ou mRNA en anglais) détectés par
la technique Northern blot ou RT-PCR Protéines
détectées par Western blot (à partir dhomogénat)
ou par immunofluorescence