ESTRUTURA%20DO%20DNA

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Marcadores molecularesPCRRAPD

• Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini

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Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo
molecular oriundo de um gene expresso, como no
caso das isoenzimas, ou de um segmento específico
de DNA
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Diversas técnicas de biologia molecular estão
hoje disponíveis para a detecção de variabilidade
genética ao nível de sequência de DNA, ou seja,
para a detecção de polimorfismo genético.
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A tecnologia de DNA recombinante e o
desenvolvimento da amplificação de segmentos de
DNA via PCR abriram o caminho para uma mudança no
paradigma genético da inferência do genótipo a
partir do fenótipo, para a análise genética
direta da variação na sequência de DNA
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PCRPolymerase Chain Reaction Reação de
polimerização em cadeia ou Polimerização em
cadeia do DNA
PCR - consiste em fazer cópias de DNA in vitro,
usando os elementos básicos do processo de
replicação natural do DNA.
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PCR se constitui hoje no método de rotina para
isolar rapidamente sequências específicas a
partir de uma mistura complexa de seqüências
genômicas ou de cDNAs.
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1984 - PCR foi apresentada pela primeira em um
encontro científico
Publicação Mullis and Faloona, 1987 Saiki at al.
1988
1976 Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase
termoestável de Thermus aquaticus. 1988 Esta DNA
polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR.
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Thomas D. Brock no lago do Yellowstone
National Park
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• PCR requer 7 componentes essenciais
• DNA polimerase termoestável
• Um par de oligonucleotídeos para iniciar a
  síntese de DNA
• Deoxinucleosídeos trifosfato (dNTPs)
• Cátion divalente toda DNA polimerase requer
  cátion divalente, usualmente Mg2
• Tampão para manter o pH
• Cátions monovalentes, usualmente K (KCl)
• - DNA molde

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Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode
ser amplificada por PCR A localização da
seqüência alvo é feita pelos primers.
Oligonucleotídeos com 20 mers é usualmente
seletivo o suficiente para localizar um sítio
único em um genoma de alta complexidade, tal como
o genoma humano. O pareamento dos primers com
a seqüência alvo na template se faz pelo
estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo
o pareamento convencional descrito por Watson e
Crick A T C G
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Especificidade dos iniciadores É possível
calcular de ocorrência aleatória da seqüência n
2NK n número de sítios complementares ao
iniciador N tamanho do genoma (humano 3 x
109) K g/2GC x 1-gAT g conteúdo
relativo de GC Este cálculo mostra que um
oligonucleotídeo de 15 nts está representado uma
única vez no genoma. Devido às seqüências
repetidas e às famílias de proteínas, menos de
85 do genoma de mamíferos pode ser encontrado
com precisão, mesmo com iniciadores de 20 nts ou
mais.
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• PCR é um processo iterativo, consistindo de três
  elementos
• Desnaturação da template por aquecimento
• Pareamento dos iníciadores à seqüência alvo fita
  única
• Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase
  termoestável

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A TÉCNICA DE PCR
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(No Transcript)
15
(No Transcript)
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Amplificação da região ITS em leveduras
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841 bp
Amplificação da região ITS em S. cerevisiae
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RAPDRandom Amplified Polymorphic DNA

• É uma variação do protocolo de PCR, com duas
  características distintivas utiliza um primer
  único, e o primer tem sequência arbitrária, isto
  é, sua sequência alvo é desconhecida

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Aplicações do RAPD

• Obtenção de fingerprints genômicos de
  indivíduos, variedades e populações
• Análise da estrutura e diversidade genética em
  populações naturais, de melhoramento e bancos de
  germoplasma
• Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos
  em diferentes espécies
• Construção de mapas genéticos e localização de
  genes de interesse econômico.

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RAPD usando o primer OPA-11 em linhagens de S.
cerevisiae
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RAPD de 3 linhagens de S. cerevisiae