Diapositive 1

1
La PCR en temps réel Exemple d'utilisation au
laboratoire de Bactériologie de l'hôpital
Pellegrin Sabine Pereyre
2
PCR conventionnelle
ADN, amorces, dNTP, Taq pol
Dénaturation (95C)
30 - 35 cycles
Hybridation des amorces
Taq
Elongation (72C)
Taq
3
PCR conventionnelle
1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2-
Amplification 3- Révélation
Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2)
4
Cinétique de la PCR
5
Cinétique de la PCR
Phase plateau
Phase exponentielle
6
PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR "classique" en point final
PCR en temps réel

• Haute précision pendant la phase exponentielle
• Variabilité importante à la phase plateau

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PCR en temps réel
Basée sur la détection d'un "reporter"
fluorescent ? Signal proportionnel à la quantité
d'amplicons ? Signal détecté "en temps réel" 1-
Extraction (manuelle ou automatisée) 2-
Amplification et détection synchronisée Système
fermé, pas de manipulation post-amplification ?
Rapidité ? Faible risque de contamination
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PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR conventionnelle Gel d'agarose
PCR en temps réel Courbe de fluorescence
9
PCR en temps réel - Quantification
Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité
de produit amplifié ? Concept de "cycle seuil"
(Ct) base de la quantification
Ct ( Cycle threshold) nombre de cycle
d'amplification nécessaire pour obtenir un signal
fluorescent statistiquement significatif par
rapport au bruit de fond (valeur seuil).
Seuil fixé au dessus du bruit de fond
? Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est
concentré
10
Dérivée de la fluorescence
Ct
Nbre de cycles
11
Quantification courbes de calibration
Nombre de copies (log)
Fluorescence émise (UA)
Ct
101
106
105
102
104
Log N -0,26 Ct 10,85 R2 0,998
1
103
Cycle seuil - Ct
Nombre de cycles
Echantillon Inconnu Ct 25
12
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin ? STBR
Green I 2- Utilisation de sondes ? Hydrolyse de
sondes sondes Taqman ? Hybridation de deux
sondes FRET (Fluorescence Resonnance Energy
Transfert) ? Molecular Beacons (balises
moléculaires)
13
Principe du SYBR Green I
Agent intercalant dont l'émission de
fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN
double brin
Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence
Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double
brin naissant, entraînant une augmentation de la
fluorescence
14
Principe du SYBR Green I
L'émission de fluorescence est mesurée à la fin
de chaque cycle d'élongation (l'émission de
fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à
l'étape suivante)
15
SYBR Green Avantage - Inconvénients
Avantage - Economique - Facile d'utilisation -
Pas d'expertise particulière pour le design de
sondes fluorescentes - Non affecté par des
mutations de l'ADN cible (qui affectent
l'hybridation des sondes spécifiques) Inconvénien
ts - La spécificité repose entièrement sur les
amorces - Faux positifs, surestimation de la
quantification (le SYBRgreen se fixe à n'importe
quelle molécule d'ADN double brin y compris des
produits non spécifiques ex dimères d'amorces,
mauvais appariements) ? Analyse de la courbe de
fusion indispensable
16
Analyse de la courbe de fusion
- Chaque produit d'amplification est caractérisé
par son Tm (température de fusion melting
temperature) température pour laquelle 50 de
l'ADN double brin est dissocié - Le Tm d'un
produit d'amplification est mesuré en suivant
l'évolution de la fluorescence lorsque la
température augmente - Deux produits de PCR
diffèrent par leur Tm ? il est possible de
détecter des produits non-spécifiques, des
dimères d'amorce
17
Analyse de la courbe de fusion
Dérivée de la fluorescence
Température C
Tm 87C
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SYBR Green
Courbe de fusion
Courbe d'amplification
Fluorescence
Fluorescence
Nombre de cycles
Température C
Tm spécificité du produit d'amplification
Ct quantification
19
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin ? SYBR
Green I 2- Utilisation de sondes ? Hydrolyse de
sondes sondes Taqman ? Hybridation de deux
sondes FRET (Fluorescence Resonnance Energy
Transfert) ? Molecular Beacons (balises
moléculaires)
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Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique
Composition de la sonde ? Fluorochrome émetteur
(reporter) en 5' Ex FAM 6-carboxy-fluorescein ?
Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex
TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine ? pas
d'émission de fluorescence
21
Sondes Taqman - Principe
Cette méthode repose sur deux principes - la
technologie FRET (fluorescence resonance energy
transfer) - lactivité 5-exonucléase de la Taq
Pol
Reporter
Quencher
FP
3
5
FAM, VIC
TAMRA
3
5
RP
? Spécificité des amorces pour la PCR ?
Spécificité de lhybridation de la sonde TaqMan
22
Sondes Taqman - Principe
FP
Q
R
3
5
3
5
RP
- FRET (fluorescence resonance energy transfer)
depuis le reporteur (haute énergie) vers le
quencher (faible énergie), ?pas de signal
fluorescent émis par le reporteur quand la sonde
est intacte
23
R
Q
FP
3
5
3
5
RP
- au cours de lélongation catalysée par la Taq
Pol lactivité 5 nucléase coupe la sonde ?
libération du reporter
R
FP
3
5
3
5
RP
- lorsque la polymérisation est complétée, pour
chaque molécule dADN synthétisée un reporteur
émet de la fluorescence.
24
? La fluorescence est proportionnelle aux taux
d'hydrolyse de la sonde hybridée donc à la
quantité de produit d'amplification
25
Sondes Taqman
Avantage - Spécificité accrue Spécificité des
primers pour la PCR Spécificité de lhybridation
de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage
avec des sondes portant des fluorochromes
différents Inconvénient - Impossibilité de
réaliser des courbes de fusion
26
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
? Utilisation de 2 sondes linéaires
complémentaires d'une séquence cible - Une sonde
marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui
émet une fluorescence verte - Une sonde marquée
en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une
fluorescence rouge ? Hybridation "tête à queue "
sur l'ADN cible ? proximité des fluorochromes
Transfert d'énergie ? fluorescence rouge
En solution, bruit de fond de fluorescence verte
Pendant l'hybridation, fluorescence verte
27
FRET
Hybridation
Dénaturation
Elongation
? L'acquisition du signal se fait pendant
l'hybridation. L'accroissement de fluorescence
rouge est proportionnel à la quantité d'ADN
synthétisé
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Molecular beacons
sonde d'hybridation en épingle à cheveux
appelée balise moléculaire - Une boucle
séquence complémentaire d'une séquence cible de
l'ADN - Deux bras de séquences complémentaires -
Un fluorochrome émetteur (ex FAM, ROX, TET) -
Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il
dissipe l'énergie de l'émetteur en chaleur (FRET)
Fluorochrome émetteur
Fluorochrome suppresseur quencher
29
Molecular beacons
1- Dénaturation
balises libres pas de fluorescence
2- Hybridation
La sonde s'hybride préférentiellement à sa
séquence cible complémentaire sur la
matrice Emission de fluorescence
3- Elongation
Libération de la balise pas de fluorescence
30
Molecular beacons
Avantages - Très spécifique détections des SNP
(Single Nucleotide Polymorphisms) Si la séquence
cible ne correspond pas parfaitement à la balise
moléculaire, pas d'hybridation donc pas
d'émission de fluorescence (formation en épingle
à cheveux thermodynamiquement plus
stable) Inconvénient - Difficulté du design
des sondes d'hybridation
31
Les appareils de PCR en temps réel
32
LightCycler (Roche Diagnostics)
Utilisation de fins capillaires en verre
permettant une optimisation des échanges
thermiques
? Rotor de 32 places
33
GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems)
GeneAmp 5700
ABI Prism 7000
? Réactions en plaque de 96 puits
34
COBAS Taqman (Roche Diagnostics)
COBAS Taqman 48
(48 tests)
35
Icycler (BioRad)
? Réactions en plaque de 96 puits
36
MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett
Resesarch)
Rotor Gene
MX4000
37
SmartCycler (Cepheid)
? Tubes réactionnels conçus pour optimiser les
échanges thermiques et la sensibilité optique ?
Chaque tube peut fonctionner avec un programme
indépendant
38
Principaux appareils de PCR en temps réel
39
Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle
PCR conventionnelle PCR temps réel
Préparation de l'échantillon (lyse de l'organisme, purification des AN) Manuel Automatisé Manuel Automatisé
Amplification et détection Plusieurs étapes Système ouvert Intégré Simultané Système fermé
Système de détection Gels Radio-isotopes Enzymes Fluorochromes
Temps d'analyse 4h à 48h 20 min à 2h
Taux de contamination Moyen à fort Faible
Taux de quantification 2-3 log 5-6 log
Reproductibilité Bonne intra-labo Mauvaise inter-labo Grande (théoriquement)
Traçabilité Détection, enregistrement et analyses intégrés
Coût Gel 4-5 euros SYBR Green 4-5 euros Sondes 10 euros
40
Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie
1- Diagnostic bactériologique PCR qualitative ou
quantitative 2- Etude de la résistance aux
AB 3- Typage bactérien (génotypage)
41
1- Diagnostic bactériologique
Exemple 1 Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi) -
Bactérie responsable d'infections respiratoires
chez l'enfant et l'adulte jeune Culture
difficile, peu sensible, en 3 semaines
Antibiotiques classiquement utilisés
(ß-lactamines) inactifs ?A Pellegrin Extraction
automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) PCR en
temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de
l'adhésine P1
42
10-3
10-2
10-1
pur
Témoin culture de Mpn extraite et amplifiée
pure, 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème
43
Patient
En rouge patient positif pour M. pneumoniae
44
Diagnostic bactériologique
Exemple 2 Chlamydia trachomatis (TP
vendredi) - Bactérie responsable d'infections
génitales souvent inapparentes chez l'homme et la
femme. Complications stérilité féminine
Bactérie intracellulaire ? culture cellulaire
difficile ? A Pellegrin
- Extraction automatisée (MagNAPure, Roche
diagnostic) - PCR en temps réel Taqman sur COBAS
Taqman
45
Diagnostic bactériologique
Exemple 3 Neisseria meningitidis
(méningocoque) - Bactérie responsable de
méningites graves. Diagnostic et traitement
antibiotique sont une urgence vitale. Nécessité
d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou
vaccin) la culture bactérienne nécessite 24
heures ? A Pellegrin - Culture classique - PCR
en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb
externe)
46
Amplification du gène ctrA de N. meningitidis
Témoin
patient
47
Témoin
patient
eau
48
Diagnostic bactériologique à Pellegrin
Germes Gènes Principaux échantillons Extraction Amplification1 Intérêt
M. pneumoniae Adhésine P1 (P de mb) Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture difficile
C. pneumoniae PMP4 (P de mb) Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture exceptionnelle
C. psittacci IncA (P mb d'inclusion) respiratoires MagNA Pure Taqman Culture facile mais secteur protégé P3
C. trachomatis Plasmide cryptique Génitaux Urine MagNA Pure -COBAS Amplicor -Taqman (COBAS Taqman) Culture difficile (cellulaire)
M. genitalium Adhésine MgPa Génitaux Urine MagNA Pure SYBR Green puis Taqman Culture impossible
M. tuberculosis (BK) ARNr 16S Respiratoires LCR, divers Kit COBAS COBAS Amplicor (PCR ELISA pt final) Culture très lente
N. meningitidis ctrA (P de mb externe) LCR Manuelle2 SYBR Green Diagnostic d'urgence
B. pertussis B. parapertussis IS 481 IS 1001 Respiratoires MagNA Pure SYBR Green Culture difficile
S.aureus (/- mecA) Fragment sa442 mecA Souche isolée Manuelle2 SYBR Green Si identification difficile
PCR universelle 16S (pt fragment bactérien) ARNr 16S Prélèvements divers Manuelle2 ou MagNAPure SYBR Green Contrôle d'extraction
PCR universelle 16S (grand fragment) ARNr 16S Souche isolée Manuelle2 ou MagNAPure SYBR Green Identification bactérienne
1Amplification par PCR en temps réel sauf COBAS
Amplicor 2Extraction manuelle avec un tampon de
lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA) ? Ebullition 10
min ? centrifugation ? surnageant
49
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
Exemple Etude de la résistance à la
clarithromycine chez H.pylori H.pylori
bactérie responsable de l'ulcère
gastro-duodénal Clarithromycine AB utilisé en
association en 1ère intention
? A Pellegrin PCR en temps réel, FRET sur
Lightcycler
50
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
FRET Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible
? proximité des fluorochromes ? Transfert
d'énergie ? fluorescence rouge
- S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la
sonde (rouge) est moins bien hybridée - Si on
augmente la température, elle se détachera plus
facilement
? Réalisation de courbes de fusion
51
Température
basse moyenne élevée
Hybridation parfaite
Mismatch (mutation)
Fluorescence
Pas de fluorescence
Fluorescence si hybridation parfaite mais pas si
mutation
52
Sauvage
Mutations
ACA
AAA
AAG
AGA
? Si mutation, le Tm est plus faible ? Technique
réalisable directement à partir des biopsies
gastriques
53
3- Typage bactérien
- Typage bactérien identifier les différents
"types" ou les différentes souches d'une espèce
bactérienne - Intérêts nombreux Ex identifier
une épidémie liée à une même souche Ex
identifier un type plus virulent, résistant aux
AB , etc Exemple typage des souches de
méningocoque à Pellegrin - Il existe plusieurs
sérogroupes A, B, C, Y, W135 ? Des vaccins
existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135
mais pas contre le sérogroupe B - Objectif du
typage si diagnostic de N. meningitidis,
peut-on vacciner les sujets contacts? Si oui,
avec quel vaccin?
54
Détermination du sérogroupe de N.meningitidis
- Amplification du gène siaD (biosynthèse de la
capsule des sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou
mynB (biosynthèse des polyosides de capsule du
sérogroupe A). - Amorces spécifiques,
différentes selon les sérogroupes - PCR temps
réel SYBR Green sur ABI prism 7000 durée 2-3
heures
55
Recherche du sérogroupe B
Témoin
patient
56
Recherche du sérogroupe C
Témoin
patient
57
Confirmation analyse de la courbe de fusion
patient
Témoin
58
Recherche du sérogroupe W135
Témoin
patient
59
Conclusion
Avantages de la PCR en temps réel ?
Automatisation ? Rapidité ? Spécificité ?
Sensibilité ? Faible risque de contamination Plac
e dans un laboratoire de Bactériologie ?
Diagnostic de bactéries non ou difficilement
cultivable ? Diagnostic d'urgence ? Etude de la
résistance aux AB de bactéries difficilement
cultivables ? Typage moléculaire
60
fluorescence
nbre de cycles
61
TaqMan MGB probes

• NFQ non fluorescent quencher
• Nouvelle innovation
• MGB minor groove binder
• ?stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde
  (à son extrémité 3)
• ?sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm
  donné)