Sequenciamento usando o M

1
Sequenciamento usando o Método de Sanger

• Luiz Claudio Santana da Silva
• Maira Cicero Ferreira

2
Histórico

• 1975 primeira descrição do sequenciamento.
• Esse procedimento foi feito usando DNA
  polimerase, primer, dNTP e ddNTP marcadas por
  32P.

Sanger, Coulson, 1975.
3
dNTPs
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de
sequenciamento de DNA.
4
ddNTPS
SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997
5
ddNTPS

• Atkinson mostrou a atividade inibitória do ddTTP
  (23dideoxitimidina trifosfato).
• Após a incorporação do ddTTP ocorre a inibição da
  síntese da cadeia.

Atkinson, Deutscher, Kornberg, Russell, Moffatt.
1969
SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997
6
Metodologia

• Desnaturação do DNA de dupla fita.
• Primers iniciam a reação feita pela DNA
  polimerase, nesse momento será definido qual a
  cadeia que será usada como molde.

Sanger, Coulson, 1975.
7
Metodologia

• Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e altas
  concentrações de dNTPs.
• Em cada reação, um ddNTP é incorporado
  aleatoriamente ao invés do dNTP correspondente,
  provocando a terminação da polimerização.

Sanger, Coulson, 1975.
8
ddNTP marcada por 32P

• Feitas 4 reações uma para cada base ddNTP
  marcada por 32P.
• Formados diversos fragmentos com tamanhos
  variados, de acordo com a posição e o ddNTP
  incorporado.

Sanger, Coulson, 1975.
9
ddNTP marcada por 32P

• Feito gel desnaturante de poliacrilamida.
• A autoradiografia é feita após a corrida do gel.

Sanger, Coulson, 1975.
10
Leitura

• Após autoradiografia a ordem dos nucleotídeos,
  pode ser visualizada.
• Porém, esta será complementar ao molde.

Sanger, Coulson, 1975.
11
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de
sequenciamento de DNA.
12
Sanger, Coulson, 1975.
13
Sequenciadores automáticos

• Criado em 1986 pela Applied Biosystems.
• O princípio é o mesmo do sequenciamento manual
  feito por Sanger.
• ddNTPs são marcados por fluorescência
  característica, permitindo a distinção das
  cadeias truncada pela respectiva fluorescência.

14
Sequenciadores automáticos

• Feita a eletroinjeção onde as moléculas de DNA(-)
  em suspensão são introduzidas nos capilares.
• Cada fragmento, recebe um feixe de laser de
  argônio, que será detectado por um sistema óptico
  e uma câmara de CCD.

15
Sequenciadores automáticos

• A ordem em que os diferentes fragmentos passam
  pelo detector de fluorescência indica a sequência
  da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como
  molde.

16
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de
sequenciamento de DNA.
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
(No Transcript)
20
Formato de saída AB1
21
Formato de saída- AB1
22
Formato de saída AB1
23
Formato de saída PHD
24
Formato de saída SEQ

• NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNT
  AAAGTATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTC
  AGGATAATAGGGTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCT
  TAGGATAAAATCTAGCTGGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTT
  TTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGTTCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATG
  CAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNACCAGTTAGGATTAAAAGCAG
  GCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGTCCAA
  GGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCGGCGACGCGGTG
  ATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAGGGGACCTG
  CCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAGGGGC
  NTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGACA
  CCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGAN
  NNNACANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACT
  ACTAAANCCCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCN
  ANNNNCATNNCCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNN
  NGNNNNNAANNNNNNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNN
  NNNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN

25
Resumo do método Sanger
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de
sequenciamento de DNA.
26
Principal aspecto positivo

• Leitura de fragmentos longos.

Principal aspecto negativo

• Valor elevado por base sequenciada.

27
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de
sequenciamento de DNA.
28
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011
29
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011 Glenn, 2011
30
OBRIGADO (A) !