Molekul

1
Molekuláris farming kutatása, fejlesztése és
alkalmazása növényeknél
Dr. Miskei Márton DE, AMTC, MTK,
Kertészettudományi és Növényi Biotechnológiai Tsz.
2
DNS
Az RNS virusok kivételével az élolények örökíto
anyaga a DNS (dezoxiribonukleinsav)
3
A növények genomi DNS-e a sejtmagban található
kromoszómákba kondenzálódva
4
A növények extranukleáris DNS-e a
mitokondriumokban és a plasztiszokban található
gyurus formában
5
A transzkripció és a transzláció folyamata
6
Géntechnológia Növényi sejtek, sejtorganellumok
genetikai változtatása molekuláris biológiai
módszerekkel
GM (géntechnológiával módosított, transzgénikus)
növények Olyan növények, melyek genetikai
állományába a géntechnológia molekuláris
genetikai módszereivel idegen gént (transzgént)
juttatnak be, amely beépul, muködik és öröklodik.
7
A géntechnológia történeti áttekintése
1979 Az elso kísérletek a növényi
géntechnológiában
1980-as évek Transzformációs rendszerek
kidolgozása
1983-84 Az elso transzgénikus növények Fraley és
mtsai. Horsch és mtsai. De Block és mtsai.
8
A géntechnológia történeti áttekintése
1986 Az elso vírus- (Powel és mtsai., Baulcombe
és mtsai.), rovar- (Vaeck és mtsai.),
herbicidrezisztens (Shah és mtsai.) GM növények
1986-tól GM növény szántóföldi kísérlete (USA)
1988-tól GM növény szántóföldi kísérlete (Európa)
1994 GM növény forgalomba kerülése
9
A géntechnológia történeti áttekintése

• Elso generációs transzgénikus növények
• A mezogazdasági termelés segítése
• (vírus-, gomba-, baktérium-, rovar-, herbicid
  reszisztencia)

• Második generációs transzgénikus növények
• A növények anyagcseréjének és fejlodésének
  módosítása
• (fehérje-, zsírsav-, szénhidrát anyagcsere, érés,
  hímsterilitás)

• Harmadik generációs transzgénikus növények
• Különféle speciális anyagok eloállítása
• (élelmiszeripar, muanyagipar, gyógyszeripar)

10
Molecular pharming
Gyógyszeralapanyagok eloállítása genetikailag
módosított növényekkel (emberi fehérjék,
antitestek, vakcinák)
Transzformáció A transzgén bejuttatása a növénybe
11
I. Transzgén bejuttatása Agrobacterium
tumefaciens fertozéssel
Az agrobaktériumok a kétszikü növényeket fertozik
a sebzési helyeken
12
Vektorok

• Extrakromoszómális DNS, baktériumokra és
  egysejtu gombákra jellemzo

• A jobb túléloképességhez szükséges géneket
  tartalmazzák pl. rezisztencia gének

• Képes önállóan osztódni, így átkerül az
  utódsejtbe

• Génsebészeti módszerekkel egyszeruen
  manipulálható

13
Agrobaktérium-fertozés
14
Ti plazmid felépítése
15
Nicotiana tabacum (dohány)

• Gyorsan no, kevés törodést igenyel

• Genomja ismert

• Régóta használják a növénygenetikában

• Szöveteibol könnyen regenerálható új növény

16
Transzformáció
Fertozés agrobaktérium szuszpenzióval
17
II. Transzgén bejuttatása protoplasztokba
A növényi sejtek sejtfalát leemésztjük
Elektroporáció
PEG (Polietilén-glikol) kezelés
Regeneráltatás és szelekció
18
III. Transzgén bejuttatása génpuskával
Néhány um átméroju wolfram vagy arany részecskére
adszorbeált plazmid molekula
Génpuska nagy sebességgel lövi be a szövetekbe a
plazmidot
A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része
eltalálja a sejtmagot
Integrálódik a bevitt DNS a genomba
19
Transzformálás
Antibiotikumot tartalmú regenerációs táptalaj
20
(No Transcript)
21
Legújabb transzformációs rendszerek
Kloroplaszt transzformáció
Mitokondrium transzformáció
A gének expressziójának szabályzása
Külso szignal kapcsolja az expressziót
Az expresszió csak bizonyos szövetféleségekben
indul el
Mesterséges kromoszóma
22
Penicillium chrysogenum antifungális fehérje
(PAF) termeltetése transzgénikus dohány
(Nicotiana tabacum) növényben
23
Bevezetés

• növény transzformálás
• harmadik generációs transzgénikus növények
• fehérje termeltetés növényekkel (nagy mennyiség,
  alacsony költség)
• célkituzés
• transzformációs technikák elsajátítása
• modellszervezet dohány
• modellfehérje PAF

24
Modell rendszerek

• Dohány (Nicotiana tabacum)
• transzfromációs rendszerek
• gyorsan növo, könnyen regenerálható
• PAF - Penicillium chrysogenum antifungális
  fehérje
• kis moltömegu, bázikus, ciszetinben gazdag
• rendellenes hifák, gátolt szaporodás

25
Transzfromálási technikák

• nukleáris transzformálás
• Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid
• T-DNS szakaszba transzgén
• kloroplaszt transzformálás
• homológ rekombináció
• magas expressziós színt
• nincs pollentranszmisszió

LTR
LTR
Szelekciós marker
Szelekciós marker
Vad típusú plasztisz DNS
LTR
Transzformált plasztisz DNS
transzgén
RTR
transzgén
RTR
RTR
26
Nukleáris transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezete
• jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák
• kanamycin szelekciós marker
• PAF kazetta

LB
Kanamycin szelekciós marker
S35
RB
PAF kazetta
P2
Tnos
Tnos
27
Nukleáris transzformálás II.
Pre-Pro-mature-PAF
Pre-Pro-mature-PAFozmotin
ozmotin
Tnos
P2
GEPre-Pro-mature-PAF
38PPre-Pro-mature-PAF
mature-PAF
PAF
38Pmature-PAF
P2
38P
28
Nukleáris transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezete
• jobb (LB), bal (LB) határ szekvenciák
• kanamycin szelekciós marker
• PAF kazetta
• Agrobacterium tumefaciens transzformálása
• növények fertozése
• regenerálás kanamycin tartalmú szelekciós
  táptalajokon
• regenerált növények vizsgálata DNS, RNS szinten

29
Kloroplaszt transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezete
• jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók
• aadA szelekciós kazetta - spectinomycin,
  streptomycin
• promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia,
  transzgén
• transzformálás génpuskával

LTR
Prrn
aadA szelekciós kazetta
Mature PAF
trnC
RTR
Pro
30
Kloroplaszt transzformálás II.
31
Kloroplaszt transzformálás I.

• klónozó vektor szerkezete
• jobb (LTR), bal (RTR) oldali target régiók
• aadA szelekciós kazetta - spectinomycin,
  streptomycin
• promóter (Prrn), terminátor (TrnC) szekvencia
• transzformálás génpuskával
• regenerálás antibiotikum tartalmú táptalajokon
• transzgén beépülésének vizsgálata DNS szinten

32
Összefoglalás

• több vektorkonstrukció tervezése
• nukleáris transzformálás
• kloroplaszt transzformálás
• transzformánsok bizonyítása DNS, RNS szinten
• tervek
• kloroplaszt transzformánsoknál a homoplazmikusság
  vizsgálata Sothern blot technikával
• termelodött PAF fehérje kimutatása Western blot
  technikával
• PAF fehérje tulajdonságainak megjelenése a
  növényben gombafertozés hatására
• más gazdaságilag fontos, illetve nem fehérje
  természetu anyag termeltetése növényekkel
• további növényen kidolgozni a transzfromációs
  technikákat

33
A GM növények fogadtatása
Mérlegelni kell!
Zöld szervezetek (pl. Greenpeace)
Multinacionális cégek
http//www.greenpeace.org/india/news/gm-indian-foo
d-greenpeace-flags-the-good-the-bad
34
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni?
Nincs bizonyíték, hogy nem károsak.
...egy génkezelt krumplifajta kóros
elváltozásokat okoz az ezzel táplált
patkányokon...
35
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Csak féligazságokat hallunk! Veszélyes megenni?
2008-ban 25 országban ... 13,3 millió gazda
foglalkozott genetikailag módosított növények
termesztésével.
Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros
elterjedés mellett nem fordult elo olyan
egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek
jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan
összefüggésben lett volna a genetikailag
módosított növények termesztésével.
36
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Tények!
Allegizálhat a transzgénrol expresszálódott
fehérje A transzgén károsan befolyásolhatja a
növény fiziológiai folyamatait Antibiotikum
rezisztenciát alakíthat ki A transzgén önmaga
veszélytelen, ha az általa kódolt fehérje nem
jelenik meg az élelmiszerben A hatékony védelem
rovarírtó- és gyomirtó szerek nélkül Nagyobb
terméshozam, egészségesebb, védettebb növény
37
A GM élelmiszerek egészségkárosítása
Konklúzió

• Ne utasítsuk el tudatlanság vagy félelem miatt!
• A hagyományos növénytermesztés, védelem gyakran
  károsabb
• Lehetnek GM élelmiszerek, de több kritérium
  betartásával
• A cégtulajdonosok vállaljanak felelosséget a
  termékeikért
• Tudjuk meg mit és hogyan módosítottak (legalább
  szakmai körökben)
• Amit megeszünk ne akkumuláljon gyomirtót,
  nehézfémet...
• Legyen vizsgálva az allergizáló hatása, és
  okoz-e toxicitást
• Legyen tényleg olcsó, hogy segítsen az éhínség
  problémáján

38
A GM növények ökológiai hatása
Jelentosebb az ökológiai kockázat
A természeti környezetbe való kijutásával a
génmódosított élolény beporzással, vagy a magok
kihullása révén ellenorizhetetlenül
keresztezodhet más, rokon fajtákkal, így
elszennyezve azok genetikai állományát.
A ma termesztett génmódosított növények 99-a
gyomirtószerekkel, illetve kártevokkel szembeni
ellenálló-képességet hordoz, amely tulajdonságok
a fogyasztó számára semmilyen kézzelfogható
elonnyel nem járnak.
39
A GM növények ökológiai hatása
Jelentosebb az ökológiai kockázat
Az 2008-ig 13 éves, 700 millió hektáros
elterjedés mellett nem fordult elo olyan
egészségügyi vagy környezeti probléma, amelynek
jelentkezése tudományosan bizonyíthatóan
összefüggésben lett volna a genetikailag
módosított növények termesztésével.
A spanyol és az ahhoz hasonló eredményt nyújtó
francia és német kísérletek alapján legfeljebb 20
m izolációs távolság szükséges a genetikailag
módosított és hagyományos kukorica tábla között,
a 0,9 százalék feletti keveredés elkerüléséhez. A
0,9 alatti véletlenszeru keveredés a
biotermékek esetében is megengedett az Európai
Uniós szabályozás alapján.
40
A GM növények ökológiai hatása
Tények
Létezik a pollentranszmisszió Olcsóbb az
élelmiszerek eloállítása Felfigyeltek a kutatók
is a kockázati tényezokre Gyakran GM növények
végzik a környezeti károk felszámolását (nehézfém
mentesítés)
41
A GM növények ökológiai hatása
Konklúzió
Új módszerek fejlesztése feloldhatja az ökológiai
kockázatot (kloroplaszt trasnszformáns,
szabályozott expresszió) Ne termesszék egymás
közelében a transzgént tartalmazó növényt és az
azzal rokon vad típusú növényt Ha biztonságos és
olcsó egyben, akkor alkalmas a nagymennyiségu
élelmiszer eloállításra Alternatíva a zárt
rendszeru nagyüzemi termelés (bioreaktor,
nagyüzemi üvegház)
42
A GM növények gyógyszer- és ipari alapanyag
eloállításra
Zárt rendszerben, megfelelo ipari technológiával
hatékonyan termelheto és kivonható a kívánt
alapanyag Alkalmas ipari alapanyag eloállítására,
kiváltva költségesebb, környezetet károsító
technológiákat Nagymennyiségu, biztonságos
vakkcinák eloállítására, hormonok és más drága
enzimek eloállítására használható Eloállíthatóak
olyan fehérjék, melyek révén nem fehérje
természetu alapanyagok létrehozhatók
43
A GM növények szigorú szabályozása
EU komolyan veszi a kockázatokat, ezért
biztonságos, de gyakran nehézkes a GM növények
termesztése, eloállítása EU színten
szúrópróbaszeruen ellenorizhetoek az egyes
laboratóriumok, cégek Magyarországom a FVM
foglalkozik a laboratóriumok akkreditálásában Komo
ly engedélyeztetési eljárás Szigorú
hulladékmegsemmisítés és szállítás
44
Elfogadjuk a GM növényeket?
?
http//www.eurekastreet.com.au/article.aspx?aeid8
150
http//www.wired.com/techbiz/people/magazine/15-07
/st_kia
Nehéz kérdés, de vajon kell dönteni?
Gondolkozzunk józanul!
45
Köszönöm a figyelmet