Title: Molekul
1Molekulárna diagnostika infekcných ochorení CNS
- MVDr. Katarína Domaracká, PhD.
- MVDr. Monika Novikmecová
- MUDr. Iveta Fandáková
- MUDr. Zuzana Szövényiová
2Princíp PCR-polymerázová retazová reakcia
- Polymerázová retazová reakcia (PCR, polymerase
chain reaction) umožnuje selektívne zmnoženie
(amplifikáciu) urcitej oblasti DNA spôsobom
podobným in vivo DNA replikácii, pricom velkost
amplifikovaného úseku ohranicujú dva
oligonukleotidy primery. - (1985, Kary Mullis)
3Cielová dvojvláknová DNA
Mechanizmus PCR reakcie
Pociatocná denaturácia DNA 94-95C, 5
Annealing primerov 30-60C, 30
Primery sú predlžované prostredníctvom aktivity
Taq polymerázy
Nové retazce 74C, 2-5
ncykly sa opakujú
Denaturácia DNA 95C, 30
4VZORKA
IZOLÁCIA DNA, RNA
AMPLIFIKÁCIA
DETEKCIA
5Využitie PCR v diagnostike infekcných ochorení
- baktérie
- Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi,
- Mycoplasma sp., Chlamydia sp.,
- Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae,
- Mycobacterium sp........
- vírusy
- CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy
- papilomavírusy, hepatitída B a C...
- fungi
- faktory virulencie, gény rezistencie
6CSF ako vzorka pre PCR
- jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri
diagnostike infekcií CNS - PCR- ideálna pre dg. tažko kultivovatelných
- mikroorganizmov
- možnost pozitívneho nálezu aj po aplikácii
nízkych dávok antivirotík (inhibujú tradicné
kultivácie) - casová výhoda oproti sérologii (tvorba protilátok
trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v case
najvyššej replikácie
7Senzitivita PCR v CSF
- nízka senzitivita (falošná negativita)
- príciny
- - nízka hladina vírusu vo vzorke
- - clearance- silné neutralizujúce protilátky
- - inhibítory produkty rozpadu erytrocytov
- !PCR neovplyvnuje xantochrómia, vysoká hladina
bielkovín a leukocytov !!!
8Špecificita PCR v CSF
- pozitívny výsledok indikuje prítomnost nukleovej
kyseliny vírusu (súcasná alebo pretrvávajúca
vírusová infekcia) - Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú
infekciu falošná pozitivita) - - porušenie hematoencefalickej bariéry
- (bakteriálna meningitída, kontaminácia
krvou) - - prítomnost infikovaných Leu (CMV)
9Diagnostika herpesvírusových infekcií CNS
- !Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových
infekcií CNS! - (DeBiasi a kol, 2004)
- problém pretrvávanie latentných
herpesvírusov u zdravej populácie - (ich genóm je ciel pre PCR)
- !Dôležité zvážit výskyt pozitívneho nálezu!
-
10Herpes simplex vírus 1 a 2
- HSV1 aj HSV 2 najcastejšia komplikácia
postihnutie CNS - HSV1 najcastejšia endemická encephalitis v
rozvinutých krajinách - pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2) korešponduje
vždy s klinickým obrazom a je gold standard pre
diagnózu, s približne 96 senzitivitou a 99
špecificitou (Boivin a kol. , 2004)
11Kinetika HSV pozitivity v CSF
- prvotné štúdie pozitívny výsledok hned po
infekcii - novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok pocas
prvých 72 h - nevhodné hodnotit negatívny výsledok pocas prvých
72 hodín, PCR test má byt opakovaný na 4 až 7 den
po objavení symptómov - nevhodné prerušit terapiu antivirotikami na
základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil a
kol, 2002) - u pacientov so symptómami viac ako jeden až dva
týždne simultánne PCR a sérologia
12Vplyv terapie na PCR pozitivitu HSV v CSF
- Lakemann a kol. dlžka antivirot. terapie
- - 1 týžden žiaden vplyv na pozitivitu
- - 8-14 dní - 47 pozitivita
- - viac ako 2 týždne - 21 pozitivita
- ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po ukoncení
terapie acyklovirom dalšia terapia (Cinque a
kol. 2002)
13PCR diagnostika CMV
- kvalitatívna latentní nosici
- moc,krv EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF
- plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny
- !Problém odlíšit latentnú a akútnu infekciu na
základe PCR diagnózy! - kvantitatívna PCR (real-time PCR)
- monitoruje fluorescenciu emitovanú pocas reakcie
ako indikátor produkcie amplikónov v každom PCR
cykle (v reálnom case) - umožnuje kvantifikovat hladinu virémie v krvi,
cím nepriamo monitoruje úcinnost terapie -
14EBV
- hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v CSF je
stále nejasné - DNA EBV je casto detekovaná aj pri absencii
neurologických porúch - Výnimka!
- AIDS - associated primary CNS lymfoma
- (citlivost 83-100 )
- (špecificita 88-100)
- (Boivin a kol. 2004)
15CSF- manipulácia a odosielanie
- pre analýzu potrebné minimálne množstvá CSL,
senzitivita závislá na objeme vzorky - 200 - 300 ul ideálne množstvo
- optimálne - cerstvé vzorky dorucené co
najrýchlejšie po odbere! - krátkodobé skladovanie -20C, (1-2 dni)
-
16 Pomocou metódy PCR vyšetrujeme aj nasledujúce
patogény
- Chlamydia trachomatis
- Ureaplazma urealyticum parvum
- Mycoplasma spp. (MgeMhoMpnMfeMpe)
- HPV high risk (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45)
- Neiseria gonorhoeae
- Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia
BAL)
17Lymská borelióza (LB)
- Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA)
- Borrelia garini
- Borrelia afzelii
- rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité
mikroaerofilné tažkokultivovatelné baktérie - antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz)
- unikátna baktéria z mikrobiologického aj z
molekulárneho hladiska (najviac plazmidov),
umožnuje jej prežit v prostredí - bezstavovcov aj stavovcov
Európa B. senzu lato
18(No Transcript)
19Nepriama - sérologická diagnostika
- 1. stupen (IF, ELISA) detekcia IgM a IgG
protilátok - - ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp.
jeho konzervatívnu doménu C6 - - v ojedinelých prípadoch pozorujeme skríženú
reaktivitu s EBV, iné herpetické - alebo spirochétové infekcie
- 2. stupen IMUNO BLOT ( Western blot)
- - konfirmácia špecificity protilátok !!!!
- - v prípade nepriekaznej klinickej
symtomatológie - a pozitivity protilátok v sérologických
reakciách
20western blot- v prípade nepriekaznej klinickej
symtomatológie a pozitivity protilátok v
sérologických reakciách
Antigén p100 p58 BmpA VlsE OspC p41i DbpA
- IgM - OspC - tvorí sa po vniknutí do organizmu
Bicíkové proteíny
(flagelín p41) - IgG - VslE lipoproteín,zodpove
dá za únik pred imunitou má kozervatívnu
doménu C6 DbpA (Osp17, p18), DbpB OspA OspB
- povrchové proteíny ktoré borélia tvorí aby
unikla imunite kliešta, prípadne imunite hostitela
Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou
(Wilske a kol.2007)
21LB-priama diagnostika
- PCR plazmidová, chromozomálna DNA
- biopsia kože, moc
- - v štádiách EM (erytema migrans) a ACA
(acrodermatitis - chronica atroficans) - vysoká senzitivita
- synoviálna tekutina vysoká senzitivita
- CSF - odporúca sa vo vcasných štádiách LNB
- - najvyšší záchyt DNA borelií je do 6 týždnov
- od výskytu prvých symptómov
ochorenia - - v neskorších štádiách neuroboreliózy
senzitivita - metódy klesá (EFSN guidelines,
2010) -
-
-
!!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚCA POUŽIT
KRV ANI SÉRUM!!!!!!!
22Výhody PCR v diagnostike infekcných ochorení
- vysoká senzitivita (1-10 baktérií
- 10-100 PFU/vzorka)
- vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov)
- minimálne množstvo vzorky (výnimka moc)
- detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických
infekcií - detekcia tažko kultivovatelných mikroorganizmov
- rýchlost
23Nevýhody PCR
- INTERPRETÁCIA
- informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna
PCR!) - ! to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke
prítomná! - neinformuje o
- - imunitnej odpovedi organizmu
- - citlivosti na antibiotiká
- detekuje aj prítomnost mrtvych mikroorganizmov vo
vzorke (Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne
po ukoncení liecby doxycyklínom, Bauwens a kol.
1993) - vysoké riziko kontaminácie pri odbere a
spracovaní vzorky - prítomnost inhibítorov vo vzorke (talk,
heparín...), falošne negatívne výsledky
(duplicita odberu) - financná a technologická nárocnost
24avilab_at_avilab.sk
Adresa Rastislavova 43 Košice Tel.
kontakt 055 / 615 23 74
615 23 75
615 23 76