Molekul - PowerPoint PPT Presentation

1 / 24
About This Presentation
Title:

Molekul

Description:

Title: PowerPoint Presentation Last modified by: Domaracky Created Date: 1/1/1601 12:00:00 AM Document presentation format: Prezent cia na obrazovke – PowerPoint PPT presentation

Number of Views:142
Avg rating:3.0/5.0
Slides: 25
Provided by: skolasmSk
Category:

less

Transcript and Presenter's Notes

Title: Molekul


1
Molekulárna diagnostika infekcných ochorení CNS
  • MVDr. Katarína Domaracká, PhD.
  • MVDr. Monika Novikmecová
  • MUDr. Iveta Fandáková
  • MUDr. Zuzana Szövényiová

2
Princíp PCR-polymerázová retazová reakcia
  • Polymerázová retazová reakcia (PCR, polymerase
    chain reaction) umožnuje selektívne zmnoženie
    (amplifikáciu) urcitej oblasti DNA spôsobom
    podobným in vivo DNA replikácii, pricom velkost
    amplifikovaného úseku ohranicujú dva
    oligonukleotidy primery.
  • (1985, Kary Mullis)

3
Cielová dvojvláknová DNA
Mechanizmus PCR reakcie
Pociatocná denaturácia DNA 94-95C, 5
Annealing primerov 30-60C, 30
Primery sú predlžované prostredníctvom aktivity
Taq polymerázy
Nové retazce 74C, 2-5
ncykly sa opakujú
Denaturácia DNA 95C, 30
4
VZORKA
IZOLÁCIA DNA, RNA
AMPLIFIKÁCIA
DETEKCIA
5
Využitie PCR v diagnostike infekcných ochorení
  • baktérie
  • Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi,
  • Mycoplasma sp., Chlamydia sp.,
  • Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae,
  • Mycobacterium sp........
  • vírusy
  • CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy
  • papilomavírusy, hepatitída B a C...
  • fungi
  • faktory virulencie, gény rezistencie

6
CSF ako vzorka pre PCR
  • jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri
    diagnostike infekcií CNS
  • PCR- ideálna pre dg. tažko kultivovatelných
  • mikroorganizmov
  • možnost pozitívneho nálezu aj po aplikácii
    nízkych dávok antivirotík (inhibujú tradicné
    kultivácie)
  • casová výhoda oproti sérologii (tvorba protilátok
    trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v case
    najvyššej replikácie

7
Senzitivita PCR v CSF
  • nízka senzitivita (falošná negativita)
  • príciny
  • - nízka hladina vírusu vo vzorke
  • - clearance- silné neutralizujúce protilátky
  • - inhibítory produkty rozpadu erytrocytov
  • !PCR neovplyvnuje xantochrómia, vysoká hladina
    bielkovín a leukocytov !!!

8
Špecificita PCR v CSF
  • pozitívny výsledok indikuje prítomnost nukleovej
    kyseliny vírusu (súcasná alebo pretrvávajúca
    vírusová infekcia)
  • Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú
    infekciu falošná pozitivita)
  • - porušenie hematoencefalickej bariéry
  • (bakteriálna meningitída, kontaminácia
    krvou)
  • - prítomnost infikovaných Leu (CMV)

9
Diagnostika herpesvírusových infekcií CNS
  • !Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových
    infekcií CNS!
  • (DeBiasi a kol, 2004)
  • problém pretrvávanie latentných
    herpesvírusov u zdravej populácie
  • (ich genóm je ciel pre PCR)
  • !Dôležité zvážit výskyt pozitívneho nálezu!

10
Herpes simplex vírus 1 a 2
  • HSV1 aj HSV 2 najcastejšia komplikácia
    postihnutie CNS
  • HSV1 najcastejšia endemická encephalitis v
    rozvinutých krajinách
  • pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2) korešponduje
    vždy s klinickým obrazom a je gold standard pre
    diagnózu, s približne 96 senzitivitou a 99
    špecificitou (Boivin a kol. , 2004)

11
Kinetika HSV pozitivity v CSF
  • prvotné štúdie pozitívny výsledok hned po
    infekcii
  • novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok pocas
    prvých 72 h
  • nevhodné hodnotit negatívny výsledok pocas prvých
    72 hodín, PCR test má byt opakovaný na 4 až 7 den
    po objavení symptómov
  • nevhodné prerušit terapiu antivirotikami na
    základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil a
    kol, 2002)
  • u pacientov so symptómami viac ako jeden až dva
    týždne simultánne PCR a sérologia

12
Vplyv terapie na PCR pozitivitu HSV v CSF
  • Lakemann a kol. dlžka antivirot. terapie
  • - 1 týžden žiaden vplyv na pozitivitu
  • - 8-14 dní - 47 pozitivita
  • - viac ako 2 týždne - 21 pozitivita
  • ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po ukoncení
    terapie acyklovirom dalšia terapia (Cinque a
    kol. 2002)

13
PCR diagnostika CMV
  • kvalitatívna latentní nosici
  • moc,krv EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF
  • plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny
  • !Problém odlíšit latentnú a akútnu infekciu na
    základe PCR diagnózy!
  • kvantitatívna PCR (real-time PCR)
  • monitoruje fluorescenciu emitovanú pocas reakcie
    ako indikátor produkcie amplikónov v každom PCR
    cykle (v reálnom case)
  • umožnuje kvantifikovat hladinu virémie v krvi,
    cím nepriamo monitoruje úcinnost terapie

14
EBV
  • hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v CSF je
    stále nejasné
  • DNA EBV je casto detekovaná aj pri absencii
    neurologických porúch
  • Výnimka!
  • AIDS - associated primary CNS lymfoma
  • (citlivost 83-100 )
  • (špecificita 88-100)
  • (Boivin a kol. 2004)

15
CSF- manipulácia a odosielanie
  • pre analýzu potrebné minimálne množstvá CSL,
    senzitivita závislá na objeme vzorky
  • 200 - 300 ul ideálne množstvo
  • optimálne - cerstvé vzorky dorucené co
    najrýchlejšie po odbere!
  • krátkodobé skladovanie -20C, (1-2 dni)

16
Pomocou metódy PCR vyšetrujeme aj nasledujúce
patogény
  • Chlamydia trachomatis
  • Ureaplazma urealyticum parvum
  • Mycoplasma spp. (MgeMhoMpnMfeMpe)
  • HPV high risk (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45)
  • Neiseria gonorhoeae
  • Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia
    BAL)

17
Lymská borelióza (LB)
  • Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA)
  • Borrelia garini
  • Borrelia afzelii
  • rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité
    mikroaerofilné tažkokultivovatelné baktérie
  • antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz)
  • unikátna baktéria z mikrobiologického aj z
    molekulárneho hladiska (najviac plazmidov),
    umožnuje jej prežit v prostredí
  • bezstavovcov aj stavovcov

Európa B. senzu lato
18
(No Transcript)
19
Nepriama - sérologická diagnostika
  • 1. stupen (IF, ELISA) detekcia IgM a IgG
    protilátok
  • - ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp.
    jeho konzervatívnu doménu C6
  • - v ojedinelých prípadoch pozorujeme skríženú
    reaktivitu s EBV, iné herpetické
  • alebo spirochétové infekcie
  • 2. stupen IMUNO BLOT ( Western blot)
  • - konfirmácia špecificity protilátok !!!!
  • - v prípade nepriekaznej klinickej
    symtomatológie
  • a pozitivity protilátok v sérologických
    reakciách

20
western blot- v prípade nepriekaznej klinickej
symtomatológie a pozitivity protilátok v
sérologických reakciách
Antigén p100 p58 BmpA VlsE OspC p41i DbpA
- IgM - OspC - tvorí sa po vniknutí do organizmu
Bicíkové proteíny
(flagelín p41) - IgG - VslE lipoproteín,zodpove
dá za únik pred imunitou má kozervatívnu
doménu C6 DbpA (Osp17, p18), DbpB OspA OspB
- povrchové proteíny ktoré borélia tvorí aby
unikla imunite kliešta, prípadne imunite hostitela
Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou
(Wilske a kol.2007)
21
LB-priama diagnostika
  • PCR plazmidová, chromozomálna DNA
  • biopsia kože, moc
  • - v štádiách EM (erytema migrans) a ACA
    (acrodermatitis
  • chronica atroficans) - vysoká senzitivita
  • synoviálna tekutina vysoká senzitivita
  • CSF - odporúca sa vo vcasných štádiách LNB
  • - najvyšší záchyt DNA borelií je do 6 týždnov
  • od výskytu prvých symptómov
    ochorenia
  • - v neskorších štádiách neuroboreliózy
    senzitivita
  • metódy klesá (EFSN guidelines,
    2010)

!!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚCA POUŽIT
KRV ANI SÉRUM!!!!!!!
22
Výhody PCR v diagnostike infekcných ochorení
  • vysoká senzitivita (1-10 baktérií
  • 10-100 PFU/vzorka)
  • vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov)
  • minimálne množstvo vzorky (výnimka moc)
  • detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických
    infekcií
  • detekcia tažko kultivovatelných mikroorganizmov
  • rýchlost

23
Nevýhody PCR
  • INTERPRETÁCIA
  • informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna
    PCR!)
  • ! to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke
    prítomná!
  • neinformuje o
  • - imunitnej odpovedi organizmu
  • - citlivosti na antibiotiká
  • detekuje aj prítomnost mrtvych mikroorganizmov vo
    vzorke (Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne
    po ukoncení liecby doxycyklínom, Bauwens a kol.
    1993)
  • vysoké riziko kontaminácie pri odbere a
    spracovaní vzorky
  • prítomnost inhibítorov vo vzorke (talk,
    heparín...), falošne negatívne výsledky
    (duplicita odberu)
  • financná a technologická nárocnost

24
avilab_at_avilab.sk
Adresa Rastislavova 43 Košice Tel.
kontakt 055 / 615 23 74
615 23 75
615 23 76
Write a Comment
User Comments (0)
About PowerShow.com