Genkloning samt vektorsystem

1
Genkloning samt vektorsystem

• Annica Nordvall Bodell
• Molekylärbiologi T3
• Ht-11

2
Kunskapsmål för detta avsnitt

• Från kursplan
• redogöra för hur vektorer är konstruerade samt
  hur dessa kan användas för kloning och isolering
  av gensekvenser.

3

• Lite mer utförligt
• De olika stegen som ingår om man ska klona en DNA
  sekvens
• Anledningar till att man vill klona gener eller
  andra sekvenser
• Beskriva hur en plasmidvektor är uppbyggd och hur
  man kan arbeta med plasmidvektorer
• Känna till bakteriofag lambda som vektor
• Skillnad mellan eukaryota och prokaryota
  vektorsystem
• Du bör också från detta avsnitt kunna förstå en
  enklare vektorkarta. Vad de olika ingående
  sekvenserna har för funktion och om vektorn kan
  användas i prokaryota eller eukaryota celler
  eller båda.
• Vad genbibliotek innebär
• Skillnad mellan genomiska bibliotek och cDNA
  bibliotek
• Principen för hur man konstruerar respektive
  bibliotek
• Hur man kan screena efter en specifik klon i ett
  bibliotek

4
Att klona en gen
Gene Cloning 1.1
5
Varför?
6
Hur gör man?1. Klyvning med restriktionsenzym
GC 4.1
7
Blunt ends och sticky ends
GC 4.9
8
2. Ligering med DNA-ligas
GC 4.20
9
Korrekt ligering kan underlättas på olika sätt

• Användning av linkers
• Defosforylering av vektorn
• Klyvning med två restriktionsenzymer

10
Linkers
GC 4.21
11
3. Transformering av bakterier kan ske genom
behandling med CaCl2 och kyla eller mha
elektroporering
GC 5.3
12
Elektroporering
Videolänk - genkloning
www.ptf.okstate.edu/pulserdiagram.gif
13
Prokaryota vektorsystem

• Värdceller framförallt E.coli stammar
• Vektorer insert
• Plasmidvektorer/ 0-10kb
• Phagemid vektorer
• Lambda vektorer 0-25kb/
• M13 vektorer ca 2kb
• Cosmidvektorer 30-44 kb
• P1, PAC och BAC 0-300kb

14
Plasmidvektorer

• Klonings- resp. expressionsvektorer
• Lätta att rena och hantera
• Kan användas för ett stort antal applikationer
  tex. protein-uttryck, sekvensering, probe
  framställning, in vitro mutagenes mm
• Många plasmidvektorer innehåller sekvenser som
  gör att vektorn (och insert) kan fås
  enkelsträngad Phagemide vektorer

15
Ex. kloningsvektor med två selektionsmarkörer
GC 5.9
16
För att uttrycka protein krävs en
expressionsvektor
17
Lambda vektorer

• Används framförallt till bibliotek
• (då man arbetar med många kloner)
• Insert upp till ca 25kb
• Fagens egen infektionscykel utnyttjas för att få
  många kopior

18
Lambda infektion
Videolänk
GC 2.6
19
Bakteriofag-kloner bildar plack
GC 5.12
20
Eukaryota vektorsystem

• Värdceller och värdorganismer som man är
  intresserad av att studera eller som fungerar för
  proteinproduktion
• Plasmidvektorer eller virusbaserade vektorer
• Transient expression vektorn integreras ej,
  fungerar under kortare tid
• Stabil expression vektorn integreras i någon av
  värdcellens kromosomer

21
Ex. plasmidvektor för expression i eukaryota
celler (HMG 5.23)
22
Transfektion av eukaryota celler leder till
transient eller stabil expression
The Cell 3.35
23
Ex 1 plasmidvektor
MCS (eller polylinker)
24
Ex 2 plasmidvektor
25
Genbibliotek

• kan användas för att hitta en gen/sekvens som ej
  tidigare har isolerats
• Man skiljer på två olika typer av bibliotek
• Genomiska bibliotek
• cDNA bibliotek

26
Genomiska bibliotek

• Hela genomet delas upp i kortare fragment (ca
  15kb) mha restriktionsenzym
• Varje fragment ligeras in i en vektor
• Alla vektorer transformeras in i värdceller och
  får växa till och bilda kloner (biblioteket)
• Här återfinns alltså alla sekvenser som finns i
  ett genom
• Hur många kloner blir det???

27
Genomiskt bibliotek
Videolänk
28
cDNA bibliotek

• Utgår från det mRNA som återfinns i en celltyp
• Omvandlar mRNA till dsDNA mha omvänt transkriptas
  cDNA
• Ligerar in alla cDNA sekvenser i vektorer
• Alla vektorer transformeras in i värdceller och
  får växa till och bilda kloner (biblioteket)
• Här återfinns alltså alla sekvenser som uttryckts
  i form av mRNA i en viss celltyp
• Hur många kloner blir det???
• Jämför med ett genomiskt bibliotek

29
Konstruktion av cDNA-bibliotek
GC 8.7
30
För att hitta rätt gen i ett bibliotek måste man
screena biblioteket
GC 5.2, se även 8.1
31
Screening med hjälp av DNA probe
GC 8.9
32
Hur kan man få en DNA probe?

• Syntetisera oligonukleotider utifrån en
  aminosyrasekvens
• Använda en besläktad (redan isolerad) sekvens som
  probe

33
Syntes av oligonukleotider utifrån
aminosyrasekvens
Cys- Met-Asp- Glu-Me-.Lys-Arg-Asn-Ile TGC/T-A
TG-GAC/T- GAG/A-ATG-AAA/G-AGA/G-AAC/T-ATT/A/C
eller CGC/A/G/T Degenererad
probe 8 olika varianter (17b) TGC/T-ATG-GAC/T-
GAG/A-ATG-AA
Unik guessmer (27b) TGCATGGACGAG
ATGAAGCGCAACATC