Dias nummer 1

1

• Genom-screening med Illumina SNP-array
• Beskrivelse af beadchippen
• Princippet bag detektion af variationer med
  SNP-array
• SNP-array fremgangsmåde
• Eksempler på resultater
• Klinisk Genetisk Afdeling, Laboratoriecenteret,
  Sygehus Lillebælt, Vejle

2
Hvad kan vi bruge genom-screening med SNP- array
til?

• Genom-screening med array bygger videre på den
  traditionelle kromosomundersøgelse
  (båndfarvnings-analyse).
• Array-teknologien er i stand til at detektere
  sygdomsgivende variationer/ubalancer (deletioner
  og duplikationer) ned til en størrelse af ca. 50
  kb og har ca. 200 gange så høj opløsning som en
  traditionel kromosomundersøgelse.
• Array-teknologien kan ikke detektere balancerede
  translokationer og inversioner
• Hele genomet screenes i en undersøgelse

Båndfarvning 14 Mb deletion
SNP-array 2,6 Mb duplikation
3
Array analyse på Klinisk Genetisk Afdeling Vejle
Oligo-array introduceres 2x100.000 prober pr.
patient
Det humane genom publiceres
2010
2011
2009
2007
2008
2003
SNP-array introduceres 300.000 unikke prober pr.
patient
Opstart BAC-array 2x4500 prober pr. patient
4
Illumina HiScanSQ maskinen kan både udføre
Next-Gen. Sekventering og SNP-array
5
Illumina Human CytoSNP-12 v2.1 Beadchip

• 12 patienter pr. Beadchip/kørsel
• Input 200 ng DNA
• Fokus på 250 syndrom områder samt 400
  sygdomsrelaterede gener
• Detektion af deletion, duplikation, loss of
  heterozygosity, uniparental disomi, nært
  slægtsskab hos patientens forældre samt mosaikker
• Pris 800 kr pr. patient (beadchip reagenser
  ca. 1500 kr inklusiv arbejdstid)
• Kan relativt nemt opskaleres til 48 patienter pr.
  kørsel

6
Bead design
Identifier
Specifik sekvens

• Beadstørrelse 2um
• Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der
  identificerer den enkelte bead samt en sekvens
  der er specifik for et enkelt område på genomet
  og er lokaliseret til et SNP-site
• Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens
  DNA-sekvenser

7
Bead design

• Beadstørrelse 2um
• Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der
  identificerer den enkelte bead samt en sekvens
  der er specifik for et enkelt område på genomet
  og er lokaliseret til et SNP-site
• Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens
  DNA-sekvenser

8
Beadchip design
9
Beadchip design
10
(No Transcript)
11
12 billeder pr. subarray 12 subarrays pr.
slide 144 billeder totalt (x2)
2,4 cm
12
SNP-array principHvordan bruger vi SNPs til at
detektere deletioner og duplikationer i det
humane genom?
13
Hvad er en SNP?
A C
ATTACCGAGAAGGCCGAAG TAAGGCCGAAGAGTTGAGG

• SNP står for single nucleotide polymorphism
  altså en variation af en enkelt base i det humane
  genom (fx kromosom 1 basepar position 4256335 der
  har de fleste et A mens nogle har et C)
• Der er SNPs spredt ud over hele det humane genom

14
SNP-array princip

• A og T A
• C og G B

Informativ SNP!
Person 1 Person 2 Person 3 Person 4 Person
5 Person 6 Person 7 Person 8 Person 9 Person 10
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAAB
ABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB
15
Sortering af SNPs giver normalt 3 udfaldsgrupper
A
A B ABA ABABBB AB B AA AB A BA A B A
ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA
BA A BB BA B AB B A B BAB AAB AB
B A
A AA AA A AAA A A A A
A A A A A A A A AA AA
A AAA A A A A A A A A A
A A
B B B B B B B B B B B B
B BB B BB B B BB BB B B B
B B B B B B B B B B BB B BB B B
BB BB
A/B
B
16
Regioner med deletion har kun 2 udfaldsgrupper
A
A B ABA ABABBB AB B AA A
ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA
BA A BB B BAB AAB AB
B A
A AA AA AA A AAA A A AA A A
A A A A A A A A AA AA
A A A A A A
A A
B B B B BB B B BB B BBB B
B BB B BB B B BB BB B B B
B B B BB B BB B B
BB BB
A/B
B
17
Regioner med duplikation har 4 udfaldsgrupper
A
AA B B A B
A AB A A A
A B BA
A A B A A
A B BA AB A ABBAB
A BB B B AB BB B
BBABA B BA B A
BB BA B BABBB B AB
B BB B BB B BB B B B B B
B B B B B B B B B B BB B BB B BB B
B B B B B B B B B B B B
B B B B B B
B B
A A A A A A A A A A A A A
A A A A AA A A A A A A A A A
A A A A A A A A A A AA
A A A A A A
A A A
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A/B
B
18
Ved at måle SNP signaler kan vi detektere
regioner med hhv. deletion og duplikation
Normal
Deletion
A
B
A
B
Duplikation
A
B
A
B
A
B
A
B
19
SNP-array fremgangsmådeDetektion og
kvantificering af A og B SNP signaler
20
SNP-array fremgangsmåde
Blodprøvetagning
DNA-oprensning
Amplifikation
Fragmentering
Hybridisering
21
(No Transcript)
22
Hybridisering
G
G
T
C
A
A
23
Enkelt-base extension
Biotin-labelled ddNTPs
Dinitrophenol-labelled ddNTPs
G
C
G
C
A
T
C
G
A
T
T
A
24
Vask
C
C
A
G
T
T
25
Farvning
Streptavidin-GREEN
Anti-DNP-RED
C
C
A
G
T
T
26
Anti-streptavidin-biotin
Forstærkning
Anti-Ab-DNP
C
C
A
G
T
T
27
Anti-DNP-RED
Streptavidin-GREEN
Farvning 2
C
C
A
G
T
T
28
Scanning
29
Måling af GRØN og RØD signal intensitet for hver
enkelt bead
C
C
A
G
T
T
30
2,6 MB deletion på kromosom 22 22q11.2 deletions
syndrom
2,6 MB duplikation på kromosom 22 22q11.2
duplikations syndrom