Lezione venerd

1
Lezione venerdì 22_XII_

• transgenia

2
Condizioni di funzionamento
Il gene per la ricombinasi Cre deve essere
indotto e deve esprimersi al momento giusto e
nel posto giusto Ci sono linee di topi
transgenici che esprimono Cre nelle cellule
epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC
o altri sistemi Sono state fatte proteine di
fusione con il dominio mutato di legame al
ligando (ligand binding domain LBD) dellormone
degli estrogeni, in modo che la ricombinasi sia
confinata nel citoplasma finche non viene
somministrato lormone sintetico che riconosce il
recettore e fa traslocare la proteina di fusione
con la ricombinasi nel nucleo dove induce la
delezione del frammento incluso tra i due siti
LoxP (vedi esempio della figura precedente)
3
CRE LOX

• Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici
  con Gene Targeting sito e tempo specifici.
• (Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e
  P.Chambon
• - limitazioni del Gene targeting lassenza
  della funzione colpita (targetet) da mutazione
  durante le fasi di sviluppo puo risultare letale
  precludendo lo studio di funzioni possibili negli
  stadi iniziali e successivi a quello letale.
• - molti geni svolgono funzioni multiple in vari
  tipi di cellule durante lontogenesi e fase
  postnatale (pleiotropici), questo provoca
  fenotipi complessi e complica lindividuazione di
  cellule anomale prodotte da fenomeni con piu
  cause.
• leffetto di una mutazione puo essere compensata
  durante lo sviluppo manca il fenotipo alterato
  nellanimale adulto.
• Per famiglie di geni si devono mutare piu geni
  della stessa famiglia per prevenire la ridondanza
  funzionale di espressione che preclude
  lidentificazione di una funzione di un
  componente della famiglia genica.

4
Geni pleiotropici
- Definire una funzione di un gene membro di una
famiglia puo essere ancora piu complicato
quando la famiglia e coinvolta in un sistema
pleiotropico di un pathway di segnali come i
recettori per lacido retinoico o FGF. - Altri
effetti confondenti il knock-out di un gene
possono essere il rischio di danno sulla
fertilitae disordini sistemici. - In tutti
questi casi sara problematico determinare la
funzione di un gene in una frazione di cellule ad
un certo momento della vita del topo. - inoltre
nel caso di modelli animali di patologie umane
con mutazioni somatiche come il cancro - Quindi
la necessita di avere un metodo con
linattivazione condizionale di un gene e molto
forte Sono state sviluppate strategie per avere
gene-targeting condizionale in topo basato su
cellule tessuto-specifico o espressione
inducibile sito specifica del gene della
ricombinasi CRE del fago P1.
5
CRE-LOX ed RNA interference condizionale
Metodi per interferire con lespressione di un
gene stable suppression of gene expression by
RNAi in mammalian cells P.N.A.S. vol.99 n.3 pp
1443-8 P.J.Paddison et al. - mutagenesi,
mutazioni termo sensibili(condizionali),
soppressori - knock out per ricombinazione -
anticorpi contro la proteina (prodotti da un
vettore) - RNA antisenso trascritto da un
vettore - oligo antisenso Questi metodi hanno il
difetto di non essere sempre applicabili ai
sitemi eucarioti in certi casi non sono
regolabili. LRNA antisenso per funzionare deve
essere aggiunto in dosi massicce, oppure deve
essere trascritto dentro la cellula, ma il
funzionamento della interferenza e legata al
sistema Dicer, cioe ad un pathway enzimatico che
riduce lRNA specifico del messaggero in
frammenti. E stato fatto un esperimento
sfruttando il metodo CRE Lox per produrre un RNA
a doppio filamento per bloccare lenzima Dicer
stesso
6
Soppressione stabile dellespressione genica
tramite RNA interference in cellule di mammifero
7
Modello per interferenze con Cre-Lox
8
Espressione di CRE
Riduzione di 10 volte dellespressione di FF in
cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN
ds double strand ss single strand as
antisense
FF firefly luciferase REN renilla luciferase
9
Lezione 17-18 OrgTransgenici 19-1-06
La selezione tramite incroci ha prodotto
organismi innaturali almeno quanto gli organismi
transgenici. Per quanto riguarda la trasmissione
orizzontale di informazione genetica ci sono
prove che sia avvenuta per via naturale ed il
pericolo che avvenga con geni esogeni a specie
diverse che ne sono privi esiste. Ma si deve
sapere se i geni che si usano possono creare
rischio. Sicuramente il criterio di cautela è il
più sicuro. Le stesse preoccupazioni sono state
giustamente poste quando iniziarono i clonaggi
con vettori di espressione usando batteri e
reistenze ad antibiotici. Sono nati i laboratori
a contenimento negativo da cui non possono uscire
batteri ricombinanti.
10
Organismi trangenici
Dopo lesperienza con i procarioti è stato
possibile fare organismi transgenici con
organismi eucariotici. La difficoltà non era
sulla complicazione della manipolazione di
organismi pluricellulari, ma solamente tecnici.
Cioè la manipolazione del DNA è sempre la stessa,
il problema è veicolarlo ed integrarlo nei
genomi. A differenza dei batteri non ci sono
plasmidi nelle cellule degli organismi complessi.
Lintegrazione in un genoma può creare dei
problemi sia al frammento da integrare sia al
genoma ospite. Cè stata e cè una notevole
differenza tra i modi di produrre organismi
transgenici vegetali o animali. Per alcuni
organismi vegetali si possono usare con facilità
dei trasposoni che facilitano lintegrazione nel
genoma. Per integrarsi un costrutto deve comunque
ricombinare. Finchè non erano note molte sequenze
la ricombinazione era esclusa anche perché evento
raro ( 10-6)
11
Oragnismi transgenici II
Per fare ricerca i primi organismi transgenici
sono stati la Drosofila ed il Topo e tra i
vegetali Arabidopsis e Nicoziana. In generale
sono stati usati gli organismi modello già usati
in genetica di cui cerano sufficienti
informazioni. Per gli organismi vegetali il
problema principale è la veicolazione del DNA
attraverso le protezioni esterne come la
cellulosa, per cui o sono stati usati virus o
batteri trasformanti o micro sfere ti metallli
pesanti (oro) come proiettili adsorbiti col
DNA. Negli animali le cellule sono più facilmente
penetrabili e però luso dei virus come veicolo è
il metodo più efficiente, però resta il pericolo
del virus che deve essere deattivato e non deve
ricombinare per ridare origine al virus wild
type infettivo. Nel topo la tecnica iniziale è
stata quella di utilizzare la blastocisti che era
già utilizzata dai biologi dello sviluppo. Il
primo successo è stato ottenuto generando un topo
chimerico.
12
Topi chimerici e transgenici
Per fare un organismo transgenico si deve
arrivare a trasformare le cellule della linea
germinale oppure il nucleo dello zigote. Nel topo
in cui è problematico intervenire sugli uni e
sullaltro è stato utilizzata la blastocisti su
cui già veniva fatta sperimentazione. La facilità
di uso dipende dal fatto che si riconosce più
facilmente da uno zigote e si riesce a trovare
facilmente nellutero di una topolina accoppiata
durante la notte. Dopo laccopiamento in poche
ore si forma un tappo vaginale che è il segno
dellavvenuta fecondazione. La topolina da
accoppiare viene trattata con estrogeni per far
avvenire lovulazione e per aver un buon numero
di blastocisti. I primi topi chimerici sono stati
ottenuti iniettando direttamente il DNA nella
blastocisti che lo riassorbe e con buona
probabilità riesce a trasformare le cellule.
13
Dal chimerico al transgenico
Iniettando il DNA nella blastocisti qualche
cellula potrà assorbire il DNA, ma non tutte e
quindi si otterrà un topo chimerico in cui non
tutti i tessuti hanno nel genoma il DNA iniettato
(con un costrutto adatto per essere funzionale ed
esprimersi, cioè un gene completo e più spesso
artificiale, recante un promotore forte
costitutivo come quello di un virus). Questo tipo
di vettore se porta un gene per una resistenza ad
un antibiotico non deve essere diffuso fuori dal
laboratorio. Tra questi topi chimerici ci
potrebbe essere quello che ha assorbito e
ricombinato nella linea germinale e che quindi
può dare origine ad una linea transgenica. Quindi
va fatto un incrocio con un topo della linea
isogenica per poter riconoscere eventualmente dal
pelo se si è trasmesso il gene marcatore. Quindi
se si ottiene una F1 transgenica si reincrocerà
sempre con topi isogenici a quelli utilizzati per
fare il topo chimerico.
14
Controllo del topo transgenico
Come si può essere certi che il topo sia
transgenico a parte il colore del pelo (non
sempre si associa un marcatore per il colore del
pelo) ? Si deve analizzare il DNA dellanimale,
nel caso del topo si prende un frammento della
coda che non provoca troppo trauma o danno fisico
e se ne analizza il DNA tramite Southern blot o
tramite PCR. Per sapere dove si è integrato si
deve clonare il frammento corrispondente a quello
del Southern con PM alterato e sequenziarlo, con
PCR si deve fare PCR inversa e trovare la
sequenza dei frammenti limitrofi al costrutto
integrato. Se il gene che si esprime corrisponde
ad un fenotipo atteso, oppure diverso dal wt si
ha questa ulteriore verifica. Per sapere se si
sono integrate più copie con il Southern si ha
risoluzione migliore e cosa si vede? Per PCR
inversa cosa si deve fare per vedere se cè più
di una copia ?
15
Schema in cui si mostra liniezione con cellule,
col DNA è uguale
16
Come si forma la blastocisti
17
Stadi diversi di maturazione dalla morula
alla blastocisti
18
Ricombinazione omologa e cellule ES
Topi transgenici con iniezione diretta del DNA
nella blastocisti possono avere il gene esogeno
in un punto qualunque del genoma e non sempre si
potrà esprimere come vorremmo, dipende dal sito
in cui si inserisce. Potrebbe essere un sito
silente oppure che provoca danno ad una funzione
del topo, per cui non è vitale. Soprattutto si
riesce solo a fare esprimere un gene e non si può
interferire con una funzione genetica endogena
del topo, caso mai si interferisce col
metabolismo. Capecchi ed alcuni altri sono
riusciti a coltivare cellule ES embrionali
staminali di topo e a trasformarle per cui si
poteva ottenere un topo chimerico con efficienza
iniettando le cellule già con il DNA integrato e
sapendo anche dove ecc. La cosa più eclatante è
stata la possibilità di ottenere cellule ES
trasformate con DNA ricombinato in un sito
specifico per ricombinazione omologa. Prime prove
con gene HPGRT
19
Vettore per Ricombinazione omologa
I primi esperimenti di ricombinazione omologa
furono fatti da Capecchi con il gene per la
resistenza HGPRT ipoxantina-guanina
fosforibosil Transferasi. Il problema e di
selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono
pochi i geni con un fenotipo selettivo, in tale
assenza di norma si utilizza la res. per un
antibiotico. Il costrutto per far avvenire la
ricombinazione omologa deve avere una regione
omologa a quella con cui vogliamo ottenere la
ricombinazione
x x
Di solito si utilizza un costrutto che abbia due
regioni di omologia (spalle) rispetto alla
regione che si vuole inserire. La frequenza e
stata studiata ed e 1- 2 x10 -6
20
Controlli per lintegrazione di vettori con
ricombinazione omologa
Controlli delle cellule staminali ES con cui si
devono ottenere successivamente i topi
transgenici. La trasformazione delle cellule ES
si può fare per elettroporazione o con metodi
trasfettanti che permeabilizzano la menbrana, si
aliquotano le cellule e si opera la selezione per
lantibiotico. Si espandono le colonie per avere
cloni isogenici (tutte le cellule di un clone
hanno avuto lo stesso evento di ricombinazione).
Si analizzano i diversi cloni per PCR per vedere
se la ricombinazione è avvenuta come desiderata,
cioè tramite le spalle del vettore nel sito
omologo. Il vettore conterrà nella regione non
omologa di solito una resist. E magari un
marcatore di espressione (lac z che può far
colorare di azzurro le cellule ricombinanti con
lindicatore). Si amplifica per PCR partendo dal
vettore con una regione esterna
21
PCR di controllo di integrazione
resist. antibiot.
a
b
genoma org
a e b sono le sequenze omologhe al gene con cui
si vuole fare avvenire la ricombinazione ed il
Knock out della funzione, per cui per verificare
lintegrazione con PCR un primer dovrà essere
nella regione esogena e laltro nella regione
genomica limitrofa alla sequenza che è stata
inserita nel vettore che è presente in entrambe e
così permette la ricombinazione omologa
22
Topi transgenici mutanti condizionali
Il limite principale dei topi transgenici
knock-out per un gene ela possibile mortalita
degli omozigoti durante lo sviluppo. - una
soluzione per questo problema potrebbe essere
linduzione della mutazione tempo e tessuto
specifica - e stato applicato il sistema di
ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox
utilizzato anche in biologia cellulare perche
inducibile - Cre e la ricombinasi (causa
ricombinazione) e LoxP (locus di crossover in
P1), serve per mantenere una sola copia del
genoma, evita i multimeri - i siti Lox sono
costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione
centrale di 8bp - la ricombinasi fa avvenire lo
scambio di filamento tra due strutture Lox
allineate originando delezione se sono in tandem,
inversione se sono in palindrome, duplicazione se
sono su cromatidi fratelli e integrazione se ce
un elemento in un plasmide ed un altro nella
sequenza dove si integra (vedi fig. 1)
23
Mutanti condizionali

• Il sistema cre-lox

Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago
P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre, si
possono ottenere dei mutanti che perdono la
regione voluta solo attivando la ricombinasi
Cre. Si devono costruire dei vettori con siti Lox
(di solito in due introni diversi) allesterno
della regione genetica da eliminare. Si chiamano
floxed gli esoni o le regioni da excidere. Con
questa strategia si possono ottenere topi
transgenici per geni che sono letali in fasi
diverse e soprattutto con lespressione della
ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far
avvenire il knock-out del gene solo in
particolari tessuti dove si esprime o dove si
induce Cre.
24
Il costrutto per il gene floxed
25
Topi transgenici che esprimono Cre

• Controllo dellespressione di Cre tramite
  promotore tessuto specifico

Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach
I (D6) il promotore è attivato al giorno 10.5
(post coitum) Il topo D6Cre incrociato con il
topo Gtrosa (B6.129S7) ?gal si colora in blu
perché libera lespressione eliminando un gene
floxed interposto tra il promotore e LacZ.
26
sito per topi con costrutti Cre
http//authors.elsevier.com.
http//www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in
tessuti diversi
27
costrutto per un gene del SNC
28
Ligand inducible Cre Recombinase
Lattivita di molti enzimi (oncoproteins,
fattori di trascriz., RNA-binding prot., kinasi)
puo essere controllata in maniera dipendente dal
Ligando se fusa al dominio che lega il ligando
LBD (ligand binding domain) di un recettore di un
ormone steroideo. E stata fatta una proteina
chimerica attiva della ricomb. Cre - LBD del
recettore dellestrogeno (ER) per cui lattivita
della ricombinasi Cre-ER dipende dalla presenza
di 17b-estradiol. Per non avere il controllo
della proteina in presenza di estradiolo
endogeno e stato mutato il LBD del recettore ER
(Cre-ERT) in maniera da legare solo un ligando
sintetico (tamoxifen Tam, 4idrossi
tamoxifenOHT) sfruttando la mutazione nota (Gly
525 Arg). Questo costrutto funziona in cellule in
vitro. -Esperimento di espressione del gene in
topo transgenico costrutto messo sotto il
controllo del promotore/enhancer del gene IE di
CMV (citomegalovirus) il frammento PvuII del
costrutto pCMVCre-ERT iniettato in zigoti
F1(C57BL/6XSJL), analisi del transgene da DNA
caudale.
29
Prova di espressione e funzionamento su un topo
transgenico
floxed per il gene del recettore dellacido
retinoico a RXR dopo induzione di Cre (controllo
di funzionalità di Cre)
100
50
80
40
60
30
Excision of floxed marker
40
20
20
10
0
0
tail
liver
skin
spleen
brain
uterus
lung
kidney
stomach
hearth
muscle
thymus
Livello di espressione di CRE (pallini) e di
excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda
30
Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol
392 / 9Aprile pp 608-611 Disruption and sequence
identification of 2,000 genes in mouse embrionic
stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al. Gene
trapping metodo di mutagenesi per inserzione
random con vettori per geni reporter o
selezionabili. -linserzione genera la marcatura
(tags) di geni successivam. clonabili -espressione
solo se linserzione avviene in introni, esoni o
promotori di geni attivi restringendo il tipo di
geni marcabili -finqui non esiste automazione
per lidentificazione dei geni bersaglio che
possono non essere trascritti o corrispondono
alla regione 5non tradotta, Per superare
questi limiti sono stati sviluppati due nuovi
vettori per GeneTrapping VICTR3 e VICTR20
31
Gene trapping tramite Victr 3 e 20
32
Costrutti VICTR3 VICTR20
2 componenti - a) acquisizione di sequenza con
promotore della PGK (fofsfo glicerokinase) di
topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina
N-acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD
(splice donor) - b) SA (splice acceptor) fuso ad
un marker selettivo e reporter (colorimetrico)
con sito polyA (SAbgeobpA o SAIRESbgeobpA) Questi
costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni
attivi per essere marcati (trapped) e la sequenza
si individua tramite RACE 3 del cDNA di fusione
e ricerca in banca dati del gene. -Prova di
efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il
gene della Hgprt Hprt (ipoxantina-guanina
fosforibosiltransferase per ricombinazione
omologa nell introne II. (I geni Hprt e tk
timidino-kinasi mutati danno la sensibilita al
terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and
thymidine e solo Hprt resistenza alla
6-thioguanina). La sequenza della 3RACE di
colonie Purom. res. hanno confermato
lintegrazione nel sito corretto confermando la
capacita mutagenica del costrutto.
33
Race per gene trapping

• gene trapping di VICTR-3/VICTR-20

VICTR-3 è costruito per funzionare con
lintegrazione allinterno geni attivi e non
attivi. Per individuare il gene di fusione che si
ottiene si deve fare RACE 3 ed eventualmente
gene walking al 5 dopo aver individuato la
regione.
34
costrutti per gene trapping
PT1 ? geo lacz neo

• ei engrailed 2 intron ee eng 2 exon
• geo lac z - neo fusion
• pA poly adenilation signal

U3 ? geo
U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk Sup 5 E.
coli sup F tRNA
RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational
enhancer
TS4