Diapositive 1

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Les gels dagarose et de polyacrylamide
Applications à la biologie moléculaire
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le gel d'agarose
Lagar-agar
Agar-agar est un mot d'origine Malaise qui
désigne en extrême-orient la gelée obtenue à
partir de diverses algues rouges
gélidium
gracilaria
Une découverte accidentelle
Au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Une
industrie dont le Japon conserva seul la maîtrise
jusqu'à la 2ème guerre mondiale.
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De lagar-agar à lagarose
16 to 38 US /Kg
Purification plus ou moins importante
Purified Agar
38 to 60 US /kg
agarose
535 to 5 400 US /kg
Caractéristiques principales Forme un gel à
34-43C après ébullition Ne se re-solubilise
quà 85C
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L'agarose est un polymère d'un diholoside (120
000 Da)
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Organisation en double hélice
ZOOM -
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Structure dun pore du gel
Simulation de la taille des pores en fonction de
la concentration du gel
Concentration dagarose
Selon la concentration dagarose lempilement des
pores est plus ou moins important Les espaces
dans le gel sont plus ou moins petits
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Le gel dacrylamide
C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation
acrylamide
bis-acrylamide
Pourqouoi ces 2 composés sont ils nécessaires à
la polymérisation ?
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Notez la présence du double lien C-C à
l'extrémité de la molécule.
Quand un des carbones impliqués dans le double
lien prend, sous l'influence d'un initiateur,
une forme radicalaire (radical libre), il peut
attaquer le double lien C-C d'une autre molécule
1) formation spontanée ou induite d'un radical au
niveau l'initiateur I -gt I
2)La propagation de ce radical enclenche alors la
polymérisation M I -gt M M M -gtM-M M-M
M -gt M-M-M
M-M-M-Mn-M
solution visqueuse impossible à manipuler
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seul site de formation de radical par molécule
2 sites de formation de radical par molécule
Agent réticulant
Bis-acrylamide ponte les chaînes d'acrylamide
Formation dun gel
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Principaux agents réticulants
le N,N'-méthylène bisacrylamide est l'agent
réticulant le plus utilisé
Le diacrylamide de piperazine gels un peu plus
solides et résolution améliorée.
D'autres agents réticulants peuvent être utilisés
si on veut des gels "resolubilisables"
Le BAC (N,N'-bisacrylylcystamine) a des liens
disulfures qui peuvent être détruits par un
réducteur de liens disulfures.
Le DATD (N,N'-diallyltartradiamide) a des liens
diole, donnant un gel solubilisable à l'acide
périodique,
!
gels plus fragiles
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Structure du gel dacrylamide/bis-acrylamide
Quantité dacrylamide et/ou bis acrylamide
La quantité d'acrylamide
Du rapport bisacrylamide/acrylamide
La porosité du gel
Plus fine que le gel dagarose
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Applications des gels à lélectrophorèse
Principes physiques de lélectrophorèse
La méthode de l'électrophorèse est basée sur le
déplacement d'ions sous l'effet d'un champ
électrique.
Du fait de leurs caractéristiques propres et en
fonction des conditions de l'électrophorèse ces
ions auront des vitesses de migration
différentes, ils vont donc se séparer les uns des
autres. Les molécules anioniques migrent vers
l'anode et les molécules cationiques se déplacent
vers la cathode.
Le champ électrique est obtenu par un générateur
de courant continu. Le support de ce champ est
constitué par un tampon de pH et de concentration
convenables dont les ions conduisent le courant
d'un pôle à un autre.
Ce support peut être liquide  on parle alors
d'électrophorèse en veine liquide (mise au point
par Tisélius en 1937). Mais les principales
applications utilisent un support poreux (gels)
qui va stabiliser la phase liquide  on parle
alors d'électrophorèse sur support ou
d'électrophorèse de zones.
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Lélectrophorèse des molécules dADN
Les acides nucléiques macromolécules
polyanioniques uniformément chargées. (pH
7,5-8) De ce fait sous l'effet d'un champ
électrique ils peuvent migrer sur un support
solide, un gel et être séparés. La charge
relative étant constante, le système de
discrimination entre les molécules est
l'effet de filtration du gel utilisé
 Tamisage moléculaire  leur masse moléculaire
ou nombre de paires de bases pb
Eléments nécessaires
Un support
Gel dagarose ou polyacrylamide
Tampon délectrophorèse
Marqueur de poids moléculaire
Tampon de charge
colorants
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Le gel dagarose
support le plus utilisé. Les tailles de
fragments qu'il est possible de séparer sont
comprises entre 0,5 et 20 kb. Les gels sont
coulés à l'horizontale dans des appareils
transparents aux UV de manière à pouvoir suivre
périodiquement la migration. La migration est
horizontale
Vocabulaire
Cuve délectrophorèse
Dépôt déchantillon dans les
Puits du gel
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La concentration dagarose
Brin dADN de tailles différentes
CATHODE
-
Migration
ANODE

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Brin dADN de tailles différentes
CATHODE
-
Migration
ANODE

Meilleure séparation des brins de grandes tailles
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Brin dADN de tailles différentes
CATHODE
-
Migration
ANODE

Meilleure séparation des brins de petites tailles
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Correspondance tailles des brins dADN/
concentration dagarose
dagarose
Éventail de taille dADN (bp)
0,75
10000-15000
1
500-10000
1,25
300-5000
1,5
200-4000
2
100-2500
2,5
50-1000
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Cas du gel de polyacrylamide
Utilisé pour la séparation des fragments dADN
de moins de 1000 pb à la base près. Le gel est
coulé entre deux plaques de verre à l'abri de
l'oxygène. La migration est verticale. Ses
utilisations majeures   Purifier des
oligonucléotides de synthèse et éliminer des
nucléotides libres Déterminer des séquences
d'ADN. Séparer des petits fragments d'ADN
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Limportance du tampon délectrophorèse
Composition du tampon (pH 7,5-8)
La mobilité électrophorétique
Résistance ionique du tampon
En absence dions la conductance est nulle
LADN ne migre pas
Conductance élevée
Migration rapide
Résistance ionique élevée
Augmentation de la température
Exemples Tris Borate EDTA (TBE) Tris Acetate
EDTA (TAE) Tris Phosphate EDTA (TPE)
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Le tampon de charge
Tampon de charge bleu de bromophénol et/ou
xylène cyanol - glycérol - tampon
délectrophorèse.
Augmentation de la densité de léchantillon évite
que lADN sorte du puit
Ajout de couleur à l échantillon simplifiant le
dépôt.
Les 2 colorants permettent de suivre la migration
des fragments d'ADN
La migration du Xylène cyanol est "comparable" à
celle d'un fragment d'ADN de 4000 pb
La migration du bleu de bromophénol est
"comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 300 pb
Xylène cyanol
bleu de bromophénol
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Le marqueur de poids moléculaire
La distance de migration dun fragment dADN
dépend de Du temps La tension Du gel Des
concentrations de tampon De la cuve utilisée De
nombreux facteurs plus ou poins contrôlés
Mauvaise reproductibilité
Nécessité des marqueurs à chaque expérience
tailles connues mêmes conditions de
migrations que léchantillon
Détermination des tailles des fragments dans
léchantillon Indépendante des conditions
expérimentales
Indicateur de reproductibilité de lexpérience
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La visualisation des brins dADN
Le bromure déthidium
Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicaténaire
par intercalation.
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Ils occupent un site interbase sur deux jusqu'à
saturation.
Ce type de liaison est dit
"par exclusion du voisinage".
B.E.T
Les intercalants sont séparés les uns des autres
par des intervalles de 10,2 Å.
!
Le bromure d'éthidium est extrèmement dangereux
mutagène/carcinogène et nécessite de porter des
gants pour manipuler les gels lors de la
révélation et après.
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Utilisations
Dans le gel dagarose avant la migration
OU
Gel est placé dans un bain (10 min) après la
migration
Le BET émet une fluorescence orange lorsqu'il est
éclairé par des UV courts (200-300nm).
Le seuil de détection est de quelques ng.
UV
La détermination de la taille d'un fragment se
fait par rapport à la migration d'un marqueur
approprié contenant des fragments de tailles
connues.
La comparaison visuelle de la fluorescence d'un
échantillon avec celle d'une quantité d'ADN
connue (le marqueur de taille) permet d'estimer
la quantité d'acides nucléiques déposée.
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Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui
ne nécessitent pas l'emploi d'UV ni de BET le
bleu de méthylène l'azure A le bleu de
toluidine
Limite moins sensibles
La coloration au bleu de Nile semble une méthode
à la fois sensible et non dangereuse
Limite
La durée de coloration estimée à 15 h !!!
Gels après coloration par le bleu de Nile
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Application détermination de la taille exacte
de fragments dADN
Réalisation de lexpérience
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(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
Détermination des distances de migration
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Tracé de la droite log (taille) f(distance de
migration)
Permet de déterminer la taille en paires de base
d'un fragment d'ADN inconnu
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Autres applications et cas particuliers
Cas particulier des plasmides
Plasmide non coupé
pGLO
5371 pb
Plasmide est circulaire différentes
configurations influence sa migration
La forme la plus abondante 4350 pb stucture
superenroulée La forme la moins représentée
9416 pb structure circulaire, non superenroulée

M
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Dun peu plus près
Toutes les formes dun plasmide non coupé
relaché
Encombrement diminue
1 vrille
Vitesse augmente
2 vrilles
 Supercoil 
Migration des plasmides non coupés ne dépend pas
que de leurs taille mais aussi de leurs
structures
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Migration dun plasmide coupé (double coupure par
topoisomérase II)
Forme linéaire très majoritaire, relâché et
supercoil minoritaires
Autres formes enroulées en dessous su seuil de
détection
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Lélectrophorèse en champ pulsé (PGFE)
Séparation des fragments de taille supérieure à
20 kb.
Principe Changer l'orientation et/ou la polarité
du champ électrique alternativement au cours du
temps
A chaque modification du champ, la molécule
d'ADN doit se réorienter parallèlement au nouveau
champ. Le temps nécessaire à la réorientation
est proportionnel à la longueur de la molécule.
Lorsque le champ est rétabli dans son sens
initial, la molécule doit une nouvelle fois se
réorienter Ces temps de réorientation provoquent
un retardement de la migration nette qui est
proportionnel à la taille de la molécule.
Le support de migration est un gel d'agarose à
0,8 et la taille des fragments séparés est de
l'ordre de 50 kb à quelques mégabases.
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Application de la PGFE
Typage de souches bactériennes
Utilisation denzymes de restriction
reconnaissant des sites de coupure "rares",
Générant un nombre restreint de fragments dADN
de très grande taille.
La difficulté de cette technique Manipulation de
molécules de grande taille quil faut éviter
dendommager
 empaquetage 
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Electrophorèse préparative
Les principes et conditions techniques sont
identiques à ceux de l'électrophorèse analytique
Après migration, on repère les bandes
correspondant à l'acide nucléique à purifier.
Pour récupérer l'échantillon   la bande est
découpée et l'acide nucléique est obtenu
Après diffusion dans un tampon
adéquat. OU Par extraction par kit
commercial.