Diapositiva 1

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DROSOPHILA
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Ciclo vitale
La drosophila ha un ciclo vitale rapido
3mm
0,5mm
4d
1d
Fecondazione/embriogenesi
3d
1d
1d
1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di
individui in 14dd. La progenie diventa matura
sessualmente in 1 settimana.
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La Drosophila è un ottimo sistema modello

• Ha un ciclo vitale rapido e produttivo
• Animale piccolo, facile da sfamare e da crescere
  (molti individui in poco spazio)
• Piccolo genoma 105 Mb (5 genoma umano
• 4 cromosomi (2 autosomi X piccolo)
• 14.000 geni
• 100 anni di genetica
• 75 geni umani identificati in Drosophila
• MA..
• 1) I ceppi non possono essere congelati.
  Richiesta di
• coltura continua.
• 2) Non è possibile effettuare RICOMBINAZIONE
  OMOLOGA (no gene targeting)

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METODI PER CREARE DROSOPHILA MUTANTE (TRANSGENICA)
RAGGI IONIZZANTI (raggi X) SI produzione di
rotture cromosomiche visibili. Facile
identificazione del gene NO mutagenesi
complesse in porzioni limitate di tessuto
1/1000 MUTAGENESI CHIMICA (EMS etc.) SI
mutagenesi di singole basi del genoma NO
difficili da localizzare 1/10000 MUTAGENESI
mediata dai TRASPOSONI (P-elements etc.) SI
singolo evento facile da localizzare (gene
reporter) NO non random. Solo alcuni geni sono
bersaglio.
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Elementi mobili in Drosophila

• Il 15 del genoma di Drosophila è MOBILE
• Esistono 80 tipi differenti di ELEMENTI
  TRASPONIBILI
• Lunghezza tra 50-10.000bp (media 5Kb)
• Da 1 a 1000 copie nel genoma (circa 50/genoma)
• Molti sono specie specifici
• ELEMENTO COPIA
• ELEMENTO P elemento mobile del genoma.
• lunghezza variabile tra 500-2900 bp

Aggiunta RECENTISSIMA nel genoma di Drosophila
Melanogaster Studi del 1992 hanno osservato che
gli elementi P provengono da unaltra specie che
ha contaminato la D.m. intorno al 1950.
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Lelemento P
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Lelemento P
Gli elementi P si muovono mediante un meccanismo
di COPIA e INCOLLA Gli elementi P sono
presenti sui cromosomi di TUTTI I TESSUTI ma LA
TRASPOSASI E ATTIVA SOLO NELLE CELLULE GERMINALI
STOP
ORF0-ORF1-ORF2
ORF0-ORF1-ORF2-ORF3
http//www.oup.co.uk/best.textbooks/
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Lelemento P
In presenza della TRASPOSASI, qualsiasi frammento
di DNA posto tra le regioni terminali invertite
puo essere MOBILIZZATO
Tutto ciò che è allinterno delle seq
ripetute viene mobilizzato
Lelemento P si integra preferibilmente nelle
estremità 5-3 del gene ospite o tende ad
inserirsi nelle vicinanze di altri elementi P ed
ha una leggera preferenza per sequenze target
GGCCAGAC CEPPO di DROSOPHILA con elemento P
(circa 30-50 copie) ceppo P CEPPO di DROSOPHILA
senza elemento P ceppo M Lelemento P è CAUSA
della DISGENESI DEGLI IBRIDI
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Disgenesi degli Ibridi Incapacità di certi ceppi
di Drosophila di incrociarsi in modo Produttivo
poiché generano ibridi sterili (benché
fenotipicamente simili) Gli IBRIDI generati da
questi incroci sono DISGENICI Aberrazioni
cromosomiche Mutazioni Sterilità Alterata
segregazione alla meiosi
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Disgenesi degli Ibridi è ASIMMETRICA
Lelemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI
CEPPO di DROSOPHILA con elemento P ceppo P CEPPO
di DROSOPHILA senza elemento P ceppo M
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Disgenesi degli Ibridi
LA TRASPOSASI E ATTIVA SOLO NELLE
CELLULE GERMINALI (splicing)
Nel citoplasma delle UOVA di ceppo P Elevati
livelli di repressore
Riarrangiamenti cromosomici STERILITA
Nel citoplasma delle UOVA di ceppo M NO
Repressore SI Trasposasi
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(No Transcript)
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PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento
P
TRASPOSASI
Elemento P come vettore per il trasferimento
genico Spradling and Rubin (Science 1982)
sviluppano un sistema per lintegrazione delle
sequenze clonate nellelemento P nei cromosomi
della linea germinale
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PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento
P

• PLASMIDE DONATORE
• transgene di interesse (tra seq ripetute
  invertite 5P-3P)
• gene reporter (LacZ)
• Gene marker (wt occhi rossi)
• PLASMIDE conTRASPOSASI
• Codifica per trasposasi
• Sequenza ripetuta 5p difettiva TRASPOSASI
  INATTIVA

Embrione wt -/-
Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce DNA
esogeno entra in alcune cellule Nelle cellule
della linea germinale elemento P TRASPONIBILE
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PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento
P
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ROSY -
ROSY -
ROSY
ROSY -
ROSY
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DROSOPHILA TRANSGENICA

• ENHANCER TRAP
• 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI
• 3. STUDIO DI PROMOTORI

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TECNICA dellENHANCER TRAP
Un enhancer trap contiene un promotore minimo,
insufficiente di per sé, per indurre la
trascrizione. Se, dopo la trasposizione si
inserisce in una regione sotto linfluenza di un
enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe
essere trascritta in maniera che riflette
lattività dellenhancer.

• Tecnica utilizzata per
• Identificazione di nuovi geni
• Analisi dellespressione di geni
• tempo/tessuto specifici
• 3) Permette analisi molti geni
• simultaneamente

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TECNICA dellENHANCER TRAP
A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4

• A) Enhancer TRAP P(LacZ) gene reporter codifica
  per la beta-galattosidasi
• Lattività dellenhancer è localizzata tramite
  immunoistochimica o reazione con X-gal.

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A) Enhancer TRAP P(LacZ)
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• LINEE ENHANCER TRAP
• a) Banche di drosophila con pattern espressione,
  collezione di
• oltre 4000 ceppi
• b) Con incroci specifici si possono studiare vari
  pattern di
• espressione

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B) Enhancer TRAP GAL4 sistema di Lievito. GAL4
attiva trascrizione di geni a valle di UAS
(Upstream Activating Sequence) Utilizzato per
IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di
geni
LIEVITO
DROSOPHILA
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2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di
NUOVI GENI
GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto
enhancer Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso
solo se GAL4 lega la seq UAS
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(No Transcript)
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GAL4/UAS ? SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di
TRANSGENI
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• GAL4/UAS sovraespressione di TRANSGENI tessuto
  specifica

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• GAL4/UAS sovraespressione di TRANSGENI
  tessuto/tempo specifica

Collezione di ceppi di Drosophila

1. Promotore UBIQUITARIO
2. Promotore SPECIFICO (spazio)
3. Promotore Temp-SENS (tempo)

IL TRANSGENE (GENE X ) E ESPRESSO SOLAMENTE NEL
TESSUTO SPECIFICO
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• GAL4/UAS sovraespressione di TRANSGENI
  tessuto/tempo specifica

PROMOTORE Tessuto specifico
ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE
ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI
DIFFERENTI DELLO SVILUPPO
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GAL4/UAS ? SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di
TRANSGENI
SPAZIO
TEMPO
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• GAL4/UAS sovraespressione di TRANSGENI
  tessuto/tempo specifica

Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI

• WT
• MUTATO
• DELETO
• antisenso

UAS/Cbl oncogene
WT
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• GAL4/UAS sovraespressione di TRANSGENI tessuto
  specifica

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Studio del PROMOTORE
Drosophila puo essere un ottimo strumento per
lANALISI del PROMOTORE identificazione di
regioni NECESSARIE per la funzione del
Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE
fusi al gene LacZ Il geni ibrido viene fuso
nellelemento P e inserito nellembrione Lattivi
tà della betagalattosidasi permette di
identificare La regione MINIMA del PROMOTORE e
sequenze NECESSARIE alla sua regolazione
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Studio del PROMOTORE
Analisi del PROMOTORE del gene DRONC caspasi di
Drosophila essenziale per apoptosi durante lo
sviluppo embrionale del moscerino.
Distinct promoter regions regulate spatial and
temporal expression of the Drosophila caspase
dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar
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embrione
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cervello
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intestino
ghiandole salivari