INSTALACIONES

1
J.M. Zúñiga. SPEA.CIC.UGR Jornadas Armonización.
Mayo, 2011
2
Posibles mecanismos correctores

• Índices de severidad
• Escalas de invasividad
• Aplicación criterios de PF
• Fichas de supervisión (IBAs)
• Habituación y socialización.
• Técnicas de EA
• Refinements are modifications in animal-based
  procedures that
• either decrease pain, distress, and discomfort or
  increase animal
• well-being. Morton (2000).
• ILAR Journal V41(2) 2000. Humane Endpoints for
  Animals Used in Biomedical Research and Testing.
  http//dels.nas.edu/ilar/jour_online.asp?idjour_o
  nline

3
Clasificación de la severidad de los
procedimientos. Directiva, 2011

•  
• Los Estados miembros velarán por que todos los
  procedimientos se clasifiquen
• "sin recuperación"
• "leves"
• "moderados"
• "severos",

4
Severidad de un Procedimiento relacionada con

• Deprivación y rangos de variables medibles o
  cuantificables
• Conjunto de variables que pueden causar dolor,
  ansiedad o sufrimiento
• Muy relacionada con la aplicación de
• paliativos

5
Índice de severidad

• Severidad baja/Intermedia o alta.Escalas
• Descriptiva simple
• Numérica
• Analógica visual
• Melbourne
• Colorado, etc.
• Para establecer dolor agudo
• Margen discriminación observador valorar dolor.
• Margen relacionado con capacidad para percibirlo
• Hombre hasta 20 niveles de dolor desde a
  Animal lt gº sensibilidad. lt 10 niveles fiables

6
Protocolos supervisión

• Permiten detectar a los animales que experimentan
  dolor o sufrimiento intenso. Imprescindibles para
  aplicar medidas correctoras.
• Investigador debe diseñar ficha de supervisión
  individualizada antes del procedimiento,
  especialmente cuando dicho procedimiento sea de
  severidad media o alta.

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Es difícil evaluar el estado?, con un poco de
observación NO!

• Conocer conducta y apariencia normal
• Observación de signos clinicos del estado del
  animal
• Signos claves (ILAR, LASA, FELASA) y
• criterios claves (Morton Grifith, 1985)

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Ficha de supervisión

• Peso menor consumo alimento y crecimiento.
  Parámetro gtgt útil en CRÓNICOS. Pérdidas gt 20-25
  
• Aspecto
• Piloerección, pelo desordenado, sin brillo
• Estrés crónico inhiben acicalamiento
• Secreciones oculares o nasales
• Restos de diarrea en la región perianal
• Aparición halo porfirinas en ojo
  (cromodacriorrea).
• Posturas anormales antiálgidas y temblores

9

• Protocolos de supervisión
• Permiten detectar dolor o sufrimiento
• Son imprescindibles.

Aspecto del animal Piloerección Inhibición de acicalamiento Secreciones oculares, nasales o presencia de restos de diarrea Halo de porfirinas alrededor del ojo (cromodacriorrea). Posturas anormales antiálgidas
Comportamiento Inactividad y falta de interacción. Tener en cuenta fotoperiodo Automutilación, convulsiones, disnea y vocalizaciones anormales problema grave.
Respuesta a manipulación Útil solamente con personal familiarizado Respuesta excesivamente pasiva como muy agresiva, problema.
Peso del animal Pérdidas gt 20-25 son indicativas de falta de bienestar.
Variables clínicas Temperatura, frecuencia cardíaca y respiratoria indican estrés o dolor. Corticoides en heces
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RCEND POINT

•  Se define como el momento en el cual se reduce,
  minimiza o termina el dolor y/o diestrés del
  animal, mediante acciones tales como
•  Eutanasia
• Finalizar el procedimiento doloroso
• Tratamiento paliativo dolor y/o diestrés.
•  
• El EP debe ser compatible con el experimento.
• Similar el concepto de sufrimiento

11
Objetivos para definir un EP

•  Realizar las observaciones apropiadas (conducta,
  fisiología...)
• Asignar valores a las observaciones realizadas
• Determinar que observaciones son las más
  indicadoras de dolor y/o diestrés en la
  investigación
• Determinar que observaciones pueden predecir
  mejor un mayor deterioro del animal para,
  identificar el punto mas temprano donde aparecen
  los síntomas.
• Establecer EP significativo y objetivo

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Observaciones apropiadas de los animales 

• Evaluación del dolor
•  cambios de peso corporal
• apariencia física externa
• signos clínicos medibles
• cambios en la conducta espontánea
• respuestas conductuales a estímulos externos
• Importante, conocer las características
  conductuales de la especie,
• animal o cepa (los roedores y lagomorfos pueden
  NO mostrar muchos cambios conductuales aun cuando
  sufren dolor).

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Protocolo

•  Observar al animal sin molestarlo. Ver si
  manifiesta conductas normales o anormales y sus
  reacciones a estímulos externos
• Examen clínico. Los signos clínicos y las
  mediciones se anotan
• Usar tablas de cuantificación estandarizadas
  (facilitar recogidas datos).
•   signos de dolor y/o diestrés relacionados con
  la condición bajo estudio (se deben usar).

14
Posibles áreas de deprivación psicológica o
biológica-1

• Denegación de
• Alimento / agua
• Sueño / Auto limpieza
• Privacidad / Espacio vital
• Relaciones sociales / Contacto confortable
• Estimulación sensorial
• Desfogue de agresividad

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Posibles áreas de deprivación psicológica o
biológica-2

• Denegación de
• Evitación / Actividad esqueleto muscular
• Exploración/Elección
• Cambios ejecutables del ambiente
• Medioambiente natural o naturalizado
• Oportunidad para desarrollar otras pautas de
  conducta
• Analgésicos frente al dolor

16
Estudios de toxicología

• Me toca bailar con la/el más
• Mayor esfuerzo en Alternativas.
• EPAA (Asociación Europea de Enfoques
  Alternativos)

17
Public Funding for 3Rs Research Sobre 12 m

• Carcinogenomics
• VITROCELLOMICS
• INVITROHEART
• ESNATS
•  NanoTEST

• Reprotect
• Sens-it-iv
• ACuteTox
• OSIRIS
• PREDICT-IV

18
Modelos Animales en Procesos Biológicos

• Evaluación preclínica y seguridad de productos
  químicos, farmacéuticos, aditivos alimentarios,
  cosméticos u otros
• Comportamiento fisiológico/patofisiológico
  después del tratamiento con una sustancia
• Efecto farmacológico/tóxico de sustancias
• Concentraciones eficaces de medicamentos
• Efectividad y seguridad de vacunas
• Reacción a materiales/sustancias ajenos
  (xenobioticos)

19
La Gran carnicería

• Libro Blanco de sustancias químicas que impulsa
  la Comisión Europea de MA
• La Comisaria de MA de la UE, Margot Wallström,
  propone la revisión de 30.000 de los 100.000
  productos químicos que están actualmente en el
  mercado.
• OJO! Responsable la industria química

20

• El informe comunitario cifra el coste económico
  para la industria en
• 32.000.106
• La consultora Mercer Management Consulting estima
  que significaría una pérdida del 1.8 del PIB
  anual de la UE, cifras que la industria hace
  suyas.

21
Tipos de toxicidad

• AGUDA (sin supervivencia) se pueden mantener un
  mínimo de horas o días
• SUBAGUDA (supervivencia a corto plazo).
• CRÓNICA (supervivencia a largo plazo). medidas de
  control máximo.
• (i) Con observación constante
• (ii) con observación ocasional
•  

22
Tipo de test (Toxicidad)
Toxicidad Aguda Sub-aguda, hasta 28 días
Métodos que utilizan letalidad a término
ADosis letal ( LD o LD50 50 de los animales ensayados-)
B Otros métodos letales
C Métodos clínicos no letales
Toxicidad Sub-crónica crónica
D Más de 28 días incluido carcinogénesis
E Teratogenia, Mutagenicidad y Toxicidad Reproductiva
F Irritabilidad Ocular
G Irritabilidad Cutánea
H Otros
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
Li

• LifeLab

26
Tipos de ensayos

• DL50 oral en rata (15 cada 14 días por ensayo -
  dos ensayos a la vez- n 30)
• Irritabilidad dérmica  en conejo 3 cada 14
  días/ensayo 2 ensayos- n6-
• DL50 inhalatoria en ratas 10 (5 ?? y 5 ??) por
  cada nivel de dosis y aprox. son de 3 a 5
  niveles. 50 ratas cada 14 días
• Absorción dérmica 25 ratas cada 14 días por
  ensayo
• LC50 en Pez cebra. Efecto en organismos
  acuáticos. 35 (7/concentración).
• DL50 en aves (Coturnix coturnix).

27
Hepatotoxicidad provocada por plantas medicinales

• Kava kava (Pipper methysticum).
• Se le atribuyen propiedades ansiolíticas y contra
  el insomnio.
• En 2006, la FDA restringe su uso debido a efectos
  hepatotóxicos.

28
Se produce realmente dolor?

• Aprox 2.7 million (2005,UK). 21.5 test
  toxicidad
• Acute/subacute lethal studies (124.000 animals)
• Acute/subacute range-finding, limit testing,
  etc(109.000)
• Reproductive/teratogen/mutagen studies (71.400 )

29
1. LeveNiveles de severidad Directiva 2011

•  Farmacocinético, única dosis y nº limitado de
  muestras de sangre (totalizando lt 10 del volumen
  circulante). No se prevé que la sustancia cause
  ningún efecto nocivo perceptible
• Administración de sustancias por vía subcutánea,
  intramuscular, intraperitoneal, por sonda
  gástrica e intravenosa a través de los vasos
  sanguíneos superficiales. Sustancia sólo tiene un
  efecto leve en el animal, y los volúmenes se
  encuentran dentro de límites apropiados para el
  tamaño del animal
• Estudios que implican la privación a corto plazo
  de interlocutores sociales, enjaulado solitario a
  corto plazo de ratas o ratones adultos de cepas
  gregarias

30
2. Moderado

• Estudios de determinación de la gama de dosis
  causante de toxicidad aguda, subaguda y/o pruebas
  de toxicidad crónica/ carcinogenicidad, con EP no
  letales

31
3. Severo

• Toxicidad, con situaciones fisiopatológicas
  intensas y EP muerte. Ej, toxicidad aguda con una
  única dosis (ver OCDE)
• Ensayo de potencia de una vacuna, caracterizada
  por la (i) alteración persistente del estado del
  animal, (ii) enfermedad progresiva que causa la
  muerte, (iii) asociada con dolor, angustia o
  sufrimiento moderados duraderos.

32
GUIDANCE DOCUMENT ON THE RECOGNITION,
ASSESSMENT, AND USE OF CLINICAL SIGNS AS HUMANE
ENDPOINTS FOR EXPERIMENTAL ANIMALS USED
IN OECD, 2000. Environmental Health and Safety
Publications. Series on Testing and
Assessment SAFETY EVALUATION
33

• CLINICAL SIGNS AND CONDITIONS OF
• ANIMALS REQUIRING
• ACTION BY ANIMAL CARE STAFF AND
• STUDY DIRECTORS.

34
MC Toxicidad aguda

•  Interacción de compuesto con las células y los
  tejidos corporales y no sus efectos terciarios
  (físicos)
• Estudio piloto previo a la investigación para
  determinar los comportamientos indicadores de
  dolor.
• Este estudio se hace lt nº animales y dosis bajas
  para poder fijar los end points.
• También se tendrá en cuenta la morbilidad en
  lugar de la mortalidad

35
MC Toxicidad subcrónica ( 6 m) y crónica (24 m)

•  Estudio sea efectivo la supervivencia gt del 50.
•  Alojamiento para envejecidos (gt 18 meses)
• Exceso de peso lesiones en cojinete plantar,
  obesidad y tumores
• Jaulas piso sólido y un lecho adecuado.
• Agua y el alimento suministro especial.

36
MCEnfermedades infecciosas, vacunas...

• En animales infectados por bacterias Tª lt de 34ºC
  implica la muerte .
• El end point se fija cuando
• Existe perdida de peso superior al 20
• La disminución de Tª animal es gt 4ºC.
• Los signos evidentes de dolor y sufrimiento son
•  Pelo erizado // Perdida de peso
• Descarga ocular // Letargia
• Encorvamiento // Ataxia
• Hipotermia 
•  

37

• Estudios de nutrición

38
Tipos de estudios

• Relacionados con toxicidad de aditivos
  alimentarios
• Actuación y diseño de alimentos funcionales
• Alteraciones y disfunciones (anorexia, obesidad)
• Patologías del sistema digestivo

39
1. Leve

•  Alimentación con dietas modificadas, que no
  cubren las necesidades nutricionales de todos los
  animales y se prevé que causen una anomalía
  clínica leve en el periodo de estudio
•  Confinamiento a corto plazo (lt 24h) en
  j-metabólicas
•  Adición a la dieta de marcadores inertes para
  seguir el paso de la ingesta
• Retirada de alimentación durante un periodo lt a
  24h en ratas adultas

40
. Moderado

• Uso de jaulas metabólicas que impliquen una
  restricción moderada de movimientos durante un
  período prolongado (hasta 5 días)
• Estudios con dietas modificadas que no cubren las
  necesidades nutricionales de todos los animales y
  que se espera que causen una anomalía clínica
  moderada en el periodo de estudio
• Retirada de la alimentación durante 48 horas en
  ratas adultas

41
3. Severo

•  Uso de jaulas metabólicas que impliquen
  restricción severa de los movimientos durante un
  período prolongado
•  Inmovilización de ratas para inducir úlceras
  gástricas o fallo cardiaco por estrés
•  Inflamaciones o ulceraciones irreversibles en
  colon y digestivo

42
En Modelos inducidos o manipulados. Ejemplo
aplicados estudios de nutrición

• 1. Administración substancias biológicas
  activasdiabetes con aloxano o de estreptotozina.
• 2. Por manipulación quirúrgica ligadura
  pilórica hepatectomía parcial (regeneración
  hepática), etc
• 3. Por inducción basada en dietas modificadas
  carenciales o suplementadas base para el estudio
  de hiperlipemias, esclerosis vasculares,
  hipovitaminosis, cancerogénesis.

43
Modelos dolorosos (colitis o inflamación
intestinal)

• Mediante un enema de 10 mg de ácido
  trinitrobencenosulfónico (TNBS) en 0,25 ml de
  etanol al 50
• Suplementación del agua de bebida con sulfato de
  dextrano sódico (DSS) al 5 (p/v) en el agua de
  bebida.
• Por transferencia de poblaciones linfocitarias
  por vía intraperitoneal a ratones SCID.

44
Modelos inducidos

• 4. Inducción por cambios etológicos
  modificaciones de factores sociales o entorno,
  aslamiento, inmovilización.
• 5. Manipulación genética transgénicos,
  obtención de gt nº
• modelos especiales y comprensión de acción de
  tipo
• patológicos terapéuticos  

45
Ejemplos concretos

• R obesa Zucker (fa/fa). Obesa a 5 sem. edad,
  pesando a las 40 sem. doble Rnormal. Por
  hipertrofia-hiperplasia gt tamaño, nº adipocitos.
• r Non Obese Diabetes. Insulino dependiente.
  infiltración del parenquima pancreático por linf.
  CD8 y CD4, B y macrofagos.

46
Restricción de movimientos
47
Alimentación Controlada

• En períodos de tiempo fijados (uno o más /día)
  los animales consumen tanta comida como quieran
• Para estudios con estado nutricional controlado.
• Sistemas automáticos de acceso al alimento
  (chronofeeder)
• Permiten controlar la cantidad de comida 

48
Reducción inmovilización
49
Envejecimiento/ Life span
50
Los vicios adquiridos-transmitidos reciclaje y
actualización

• Reticencia aplicación de analgesia
• Ej. Con colitis ulcerosa, la acción de
  probioticos no varia con ketofen y buprenorphina
• Métodos invasivos anticuados
• Ej. Vías de administración y extracción en desuso
• Inmovilización innecesaria
• Ej retenedores vs telemetría y teledetección
• Aislamiento prolongado sin justificar
• Ej. Animales aislado en alimentación restringida
• Métodos de eutanasia inapropiados
• Ej. Inhalación éter vs sobreanestésico, CO2 vs
  C02 O2

51
Elementos dianaformación. EXP INV

• Valorar nivel de BA(grupo/individuo)
• Valorar nivel dolor/estrés/ansiedad y
• Aplicar mecanismos de reducción
• Proporcionar una batería de cuidados
• Limitar duración y severidad de condiciones
  experimentales
• Reducción de riesgos (bioseguridad)
• .. Gracias