Aula de enzimologia

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Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática
Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de
Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo USP adriane_at_debiq.eel
.usp.br
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Cinética das reações catalisadas por enzimas 1.
Efeito da concentração de substrato

• Conteúdo
• Cinética de uma reação simples
• Determinando Vmax e Km
• Significado de Km
• Cinética do tipo cooperativo

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A atividade de uma enzima e a concentração do
substrato não são, em geral, proporcionais
Qual a porcentagem dos sítios ativos estão
ocupados?
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Por que estudar a cinética enzimática?

• Determinar as constantes cinéticas do S e dos
  inibidores
• Ajudar a elucidar os mecanismos de reação
• Determinar a função de uma enzima em uma rota
  metabólica
• Conhecer as condições ótimas de catálise

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A velocidade da reação é proporcional a S
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Hipótese de equilíbrio rápido e estado
estacionário
O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar
a cinética das reações catalisadas por
enzimas. O modelo de Michaelis-Menten considera
que uma reação enzimática ocorre em dois passos

V k3 ES
K1 E S K2 ES
K2 E S K1 ES
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1) V k3 ES
K2 Ks E S K1 ES ES
E S ks
2) Et E ES
V k3 ES Et E ES
E S ks
V K3
Et E E S ks
V Vm S ks S
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Hipótese de Briggs - Haldane
ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma
enzima (E), formando um complexo intermediário
(ES)
ETAPA 2.Formação do produto (P) a partir do
complexo ES, com recuperação da forma livre da
enzima (E)
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A reação do anterior está representada no
equilíbrio onde k1, k2, k3e k4 são as
constantes de velocidade de cada etapa. Nesse
caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de
formação do produto será
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Porém, no estado inicial, podemos simplificar a
reação
A velocidade inicial de reação neste caso é dada
por
Na análise cinética da reação catalisada por uma
enzima, consideramos apenas o ESTADO
ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de
estarem mudando as concentrações de S
(diminuindo) e de P (aumentando), não há variação
da concentração dos intermediários da reação.
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Velocidade de formação de ES Velocidade de
decomposição de ES ou...k1E.S (k2 k3)ES
(eq. 3)
A equação 3 pode ser re-arranjada em
Para simplificar a equação 4, foi definida uma
constante, Km, conhecida como Constante de
Michaelis
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No numerador, temos duas constantes de
velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no
denominador, a constante de velocidade da
FORMAÇÃO de ES. Dessa forma, Km é uma medida da
AFINIDADE da enzima pelo substrato. Km ALTO
Baixa afinidade e Km BAIXO Alta afinidade
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Como toda a enzima que estiver na solução de
reação (ETOTAL) corresponde à soma das espécies
E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com
substrato),
Podemos substituir esta equação na da
velocidade inicial da reação é Vo k3.ES
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Quando todas as enzimas estão na forma de
complexo ES, atingimos a velocidade máxima de
reação, ou seja, se ETOTAL ES, então a
equação 10, pode ser representada por
Se SltltltKm, então Vo Vmax S Vo
KS
Km E se S gtgtgtgt Km, Vo Vmax V0
k3ETOTAL Se V0Vmáx/2, temos Km S. Ou
seja, Km corresponde à concentração de S
necessária para se atingir a metade da velocidade
máxima!
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• Significado de Km
• Importante parâmetro da reação enzimática e da
  função biológica
• Fornece uma medida da S para que ocorra uma
  catálise significativa
• Km esta relacionado as constantes de velocidade
  de cada etapa da reacão

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Significado do kcat/KM A Eficiência Catalitica

• É uma medida de eficiência da Enzima
• Permite comparar a preferência de uma Enzima
  para diferentes Substratos

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Significado do kcat/KM A perfeição cinética
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Determinação experimental dos parâmetros cinéticos
Diagrama Lineweaver-Burk (Duplo-Recíproco)
As concentrações de substrato escolhidas devem
ser proximas do Km
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• Críticas ao gráfico L.B.
• Aumentos iguais de S que fornecem pontos
  igualmente espaçados no grafico V x S não
  fornecem pontos igualmente espaçados no L.B.
• Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e
  aparecem poucos pontos mais altos da escala e são
  os que devem pesar no traçado da reta
• Pequenos erros na determinação de V se tornam
  maiores quando se calcula o seu recíproco.

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• Gráfico de Eadie-Hofstee
• Não envolve o recíproco de V e podem tornar mais
  precisos

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• Gráfico de Hanes-Woolf
• Mais indicado para dados obtidos com aumentos
  iguais de S

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• Exercício
• Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima
  que catalisa a reação S-P. As concentrações de
  substrato abrangem uma faixa bastante ampla para
  nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos
  lineares. Trace os gráficos e determine Km e
  Vmax.

S (M) V (nmoles/L/min)
8,33 10-6 13,8
1 10-5 16
1,25 10-5 19
1,67 10-5 23,6
2 10-5 26,7
2,5 10-5 30,8
3,33 10-5 36,3
4 10-5 40
5 10-5 44,4
6 10-5 48
8 10-5 53,4
1 10-4 57,1
2 10-4 66,7
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INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
Este gráfico mostra como varia a velocidade
inicial de uma reação com o aumento da
concentração de substrato
Ou seja,Vmáx e Km podem ser calculados quando V0
é medida em função de várias concentrações de
substrato.

• Quando S é muito grande V Vmax
• 
  P Vmax . t

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Ordem da reação
2) Quando S é muito pequeno Vo Vmax S
Vo KS
Km K é uma
constante de primeira ordem (min -1)
-dS kS dt
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• Exercício
• Uma enzima teve sua atividade determinada a uma
  concentração inicial de S de 2 x 10-5 M. Em 6
  min, metade do substrato foi utilizado. O Km para
  o substrato é de 5 x 10 -3 M . Calcule a) k, b)
  Vmax, c) concentração de produto formado em 15
  min.

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• Enzimas Alostéricas
• Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten
• Quanto maior a S maior será a atividade da E
  até esta alcançar o Vmax
• A curva da V versus S e sigmóide
• Segue modelo da curva de saturação da
  Hemoglobina com O2
• Sistema cooperativo

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Enzimas alostéricas possuem uma região
diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou
modulador alostérico. A mudança conformacional
decorrente da ligação do efetor alostérico se
propaga pela molécula e afeta o sítio ativo,
ativando-o ou inibindo-o.
Inibidor alostérico
Ativador alostérico
Gráfico V x S é uma curva sigmóide
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Enzimas com sítios múltiplos 1) Sitios
independentes (hiperbólica) 2) Sítios
interdependentes (Sigmoidal)
Enzimas tipo V efetores alostéricos alteram a
Vmax - hiperbólica Enzimas tipo K efetores
alostéricos alteram o Km - Cinética
sigmoidal (indica cooperatividade)
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k k3 E hS ------?
ESh -------? ESh-1 P V k3 ESh (1) Et E
ESh ESh E Sh / k V
k3 ESh Et E ESh V k3 E Sh /
k Et E E Sh / k V k3
Sh Et k Sh
V Vm Sh
K Sh
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Equações de V x S
S é a concentração de substrato S50 é a
concentração de substrato para a qual a enzima
está hemisaturada e em que a velocidade é metade
de Vmax. h é o coeficiente de Hill e é uma
medida do grau de cooperatividade (ou
sigmoidicidade) quando h1 a equação acima
simplifica e é igual à equação de
Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).
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A equação de Hill também é linearizável
V Vm Sh

K Sh
Rearranjando vK vSh Vm Sh Vk
VmSh vSh Vk (Vm v) Sh V
Sh Vm V k Log ( V ) h
log S - log k (Equação de Hill) (
Vm V )
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Exercício Determine se a enzima obedece uma
cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou
estime as constantes cinética apropriadas (Km,
Vmax ou K S0,5 , nap e Vmax) S (M x 104)
V (micromoles/L/min) 6,5
1,54 12,5 5,88 25
20 50 50 100
80 200
94,12 400 98,46 800
99,61
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Considerações finais
1) O estudo cinético de uma enzima nos informa
sobre o modo como a atividade da enzima se
modifica quando se alteram as condições do meio
em que esta é ensaiada. 2) O estudo cinético de
uma enzima é importante para caracterizar essa
enzima, desta maneira distinguindo-a
funcionalmente das demais enzimas inclusive das
que podem catalisar a mesma reação. 3) O desenho
de condições de ensaio adequadas à dosagem de uma
enzima numa preparação biológica complexa é feita
com base em estudos de cinética.