TERAPIA G

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TERAPIA GÊNICA
TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS

• Aconselhamento Genético
• Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

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TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS

• ? Na maioria das vezes o tratamento das doenças
  genéticas é somente paliativo, embora
  frequentemente melhore a qualidade de vida dos
  pacientes
• amenizando os sintomas ao invés de agir na causa
  primária o gene

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ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO
DOENÇAS MONOGÊNICAS -Tratamento se baseia na
reposição da proteína deficiente ? melhora do
funcionamento ou minimizando as consequências de
sua deficiência -efetivo em 12 dos distúrbios
DOENÇAS COMPLEXAS MULTIFATORIAIS -se o fator
ambiental é conhecido oportunidade efetiva de
intervenção ? modificação ou não exposição ao
fator ambiental -tratamento cirúrgico ou médico
Quanto mais precoce o diagnóstico e instituído um
tratamento ? mais favorável será a evolução dos
pacientes.
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TRATAMENTO AO NÍVEL DO FENÓTIPO AFETADO

• Transplante de órgão
• Ativação de um gene dormente
• Fornecimento da proteína
• Evitar o agente danoso
• Remoção do produto tóxico acumulado

• ADA e Talassemia Medula óssea
• Talassemia Beta Gene da cadeia ? da hemoglobina
  
• Hemofilia B fator IX de coagulação.Diabetes
  insulina
• Xeroderma pigmentosum luz solar
• Fenilcetonúria dieta baixa de fenilalanina D.
  Wilson acúmulo de cobre

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DOENÇAS MONOGÊNICAS COM TERAPIA EFETIVA

• Hiperplasia adrenal congênita reposição
  hormonal
• Fenilcetonúria restrição dietética de
  fenilalanina
• Hemofilia reposição do fator
• Imunodeficiência combinada grave transplante de
  medula
• Cistinúria ingestão de líquidos D-penicilina
• Agamaglobulinemia reposição de imunoglobulinas
• Acidúria metilmalônica vitamina B12
• Doença policística adulta transplante renal

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DOENÇAS MULTIFATORIAIS COM TERAPIAS EFETIVAS

• Fenda labial e palatina cirurgia
• Estenose pilórica cirurgia
• Cardiopatia congênita cirurgia e medicação
• Hidrocefalia cirurgia e medicação
• Hipertensão medicação
• Úlcera péptica medicação e cirurgia
• Epilepsia medicação

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CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS

• Necessidade de uma avaliação a longo prazo o
  tratamento aparentemente bem sucedido pode
  demonstrar-se imperfeito
• Após longa observação apresenta inadequações Ex.
  PKU

Manifestam distúrbios de aprendizagem e
comportamento ? prejuízo no desempenho acadêmico
Crianças bem-tratadas? escapam de RM ? QI normal
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CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS

• 2.Tratamento bem-sucedido de mudanças patológicas
  em um órgão ? podem surgir problemas inesperados
  em tecidos, antes não observados (pacientes não
  sobreviviam tempo suficiente). Ex. Galactosemia
• galactose-1-fosfato UDPG

GALT
Quadro clínico Problemas gastrintestinais Cirrose
hepática Catarata RM grave
Criança tratada Problemas de aprendizagem Mulhere
s desenvolvem insuficiência ovariana ? toxidez
continuada de galactose
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CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS

• Outros exemplos
• Cistinose acúmulo de cistina nos lisossomos ?
  insuficiência renal ? pacientes com transplante
  renal após envelhecimento ? desenvolvem
  hipotireoidismo, diabetes e anomalias
  neurológicas
• Retinoblastoma tumor de retina ? pacientes
  correm o risco de desenvolver outras malignidades
  independentes após a primeira década
  osteossarcoma

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CONSEQUÊNCIAS DO TRATAMENTO DAS DOENÇAS GENÉTICAS

• Efeitos colaterais a longo prazo
• Exemplos
• Hemofilia infusão do fator de coagulação ?
  formação de anticorpos contra a proteína
• Talassemia transfusão de sangue ? sobrecarga de
  ferro

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ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO
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TRATAMENTO DAS DOENÇAS METABÓLICAS
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Desvio Metabólico Distúrbios do ciclo da
uréia -conversão da amônia em uréia -defeito
enzimático ? hiperamonemia -benzoato de sódio ?
ligação da amônia com glicina ? hipurato
Inibição Hipercolesterolemia Familiar Lovastatina
redução 40 a 60 nos níveis de LDL-colesterol
do plasma nos heterozigotos
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TRATAMENTO NO NÍVEL DA PROTEÍNA
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TRATAMENTO POR MODIFICAÇÃO DO GENOMA OU SUA
EXPRESSÃO
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TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA DOENÇAS DE
ARMAZENAMENTO LISOSSÔMICO
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Terapia Gênica

• Envolve diversas tecnologias que têm em comum,
  um novo conceito terapêutico
• a introdução de material genético para
  atuar na causa fundamental da doença o
  gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos

• Descreve qualquer processo destinado a tratar ou
  aliviar doenças pela modificação genética das
  células do paciente.

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PROPÓSITOS DA TERAPIA GÊNICA

• Compensação gene mutante com perda de função
• Substituição gene mutante dominante (difícil) ?
  alternativa degradação do mRNA mutante
  (ribozimas ou RNA de interferência)
• Efeito farmacológico contrabalancear os efeitos
  de um gene mutante ou compensar a patogenia da
  doença, como no câncer

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FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GÊNICA

• Terapia gênica
• germinativa
• Terapia gênica
• somática

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TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

• Terapia ex vivo as células do paciente
  são retiradas e manipuladas fora do corpo
• Terapia in vivo as células são tratadas
  dentro do corpo

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(No Transcript)
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1. Inserção de um gene em um vetor 2. Contato
Vetor / Célula 3. Entrada e transporte do gene
até o núcleo da célula 4. Transcrição do RNAm a
partir do gene 5. Tradução do RNAm em proteína
6. Secreção, fixação na membrana ou expressão
citoplasmática da proteína
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PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA
Doença apropriada
Estratégia de transferência ex vivo ou in vivo
Células alvo
Vetor
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CÉLULAS ALVO

• Características acessíveis, tempo de vida longo
  no corpo, alta taxa de proliferação
• Tipos de células alvo
• Células tronco (medula óssea- cordão umbilical)
• linfócitos
• fibroblastos de pele
• células musculares (mioblastos)
• células vasculares endoteliais
• hepatócitos

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Técnicas de introdução de genes em células de
mamíferos

• A- Técnicas que utilizam métodos físicos ou
  químicos baixa eficácia e transitório
• microinjeção
• precipitado de fosfato de cálcio
• eletroporação (choque elétrico)
• lipossomos
• biobalística (gene gun)

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precipitado c/DNA- endocitose (cultura
celular ex vivo)
Microinjeção núcleo da célula (terapia ex vivo
ou in vivo- embrião)
vesícula m. lipídica
Eletroporação choque elétrico?poros (morte
celular)
Bombardeio partículas de ouro bomba de hélio
(morte celular)
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Técnicas de introdução de genes em células de
mamíferos

• B- Técnicas que utilizam vetores biológicos
• retrovírus
• Adenovírus
• Adenovírus associado-AAV (parvovírus)
• Lentivírus (retrovírus ? cels. não dividem)
• Herpes vírus (invadir neurônios)
• Cromossomo artificial

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CROMOSSOMO HUMANO ARTIFICIAL

• 5-10 Mb
• DNA telomérico humano
• DNA centromérico
• DNA genômico
• Introduzidos em células em cultivo (lipofectina)

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RETROVÍRUS

• Retrovírus (vírus de RNA) são os vetores ideais
  para a transferência de genes em células humanas
• são capazes de infectar quase 100 das
  células-alvo em divisão? integra no genoma
  hospedeiro
• carregam fragmentos relativamente grandes de DNA
  (8kb)
• Desvatagem infectam somente células em divisão

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Gag proteína cápsula interna Env transcriptase
reversa e integrase Pol envelope glicoproteína
                                                  
                                 1. DNA Humano
2. Célula reparada por terapia gênica
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Terapia Gênica

• A inserção casual do DNA no genoma das células
  hospedeiras pode
• inativar um gene importante morte celular
• ativar um oncogene alterar o padrão normal de
  controle e divisão celular
• causar mutação

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OUTROS VETORES VIRAIS

• PARVOVÍRUS vantagem de integração estável ao
  DNA (ou epissomo) células com/sem divisão
  nenhuma associação conhecida com doença humana
  Desvantagem inserção de DNA de cerca de 5kb
• HERPES VÍRUS desativado capacidade de invadir
  neurônios. Desvantagem não se integram aos
  cromossomos inviabiliza expressão a longo prazo

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(No Transcript)
34
http//www.eurordis.org/article.php3?id_article10
06
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Pré-Requisitos Terapia Gênica

• escolher a doença apropriada a ser tratada
• identificar e clonar o gene e suas regiões
  reguladoras
• assegurar que o gene inserido não tenha efeitos
  prejudiciais
• determinar as células-alvo certas que tenham
  duração de vida adequada
• verificar se a técnica é segura e eficiente para
  a introdução do gene nas células
• restringir a transferência do gene às células
  alvo somáticas
• documentar e divulgar os resultados obtidos

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Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica

• Doenças Hereditárias (monogênicas)
• Neoplasias
• Doenças infecciosas (AIDS)
• Outras Doenças doença arterial coronária
  artrite doença renal, etc
• Cerca de 650 protocolos aprovados

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• Algumas tentativas de terapia gênica
• Deficiência da enzima desaminase de adenosina
  (ADA)
• Imunodeficiência combinada severa ligada ao X
  (XSCID)
• Fibrose Cística
• Hemofília
• DMD
• Hipercolesterolemia Familial LDLR (receptor de
  lipoproteína de baixa densidade)
• Câncer
• AIDS

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Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)

• Doença imunológica rara debilitação do sistema
  imune (imunodeficiência)
• Enzima ADA via purinas (tóxica)
• linfócitos T (células-alvo) são muito acessÍveis
• grande variação no nível de expressão do gene ADA
  entre indivíduos normais
• o primeiro protocolo aprovado para terapia gênica
  foi para a correção da
• deficiência da ADA.
• 1990 Drs. Anderson e Blease
• (Ashanti De Silva)

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ADA

• linfócitos T foram coletados e expandidos em
  cultura ex vivo infectadas com retrovírus
  recombinante
• os linfócitos foram injetados nos pacientes
• expressão do gene ADA detectada por 12 anos
  nos linfócitos periféricos
• transferência do gene não foi eficiente
  receberam PEG-ADA

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DEFICIÊNCIA DA DESAMINASE DE ADENOSINA - ADA

• NOVA TÉCNICA
• gene ADA transferido para células tronco
  sangue do cordão umbilical
• 10 dos linfócitos T circulantes carregavam o
  gene normal
• tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA)
  foi removida progressivamente
• Células T expressando ADA ? significantemente

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IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA SEVERA LIGADA AO X -
XSCID

• Devido mutação do gene IL2RG codifica a cadeia ?
  do receptor IL-2
• Pacientes faltam células T e células B
  prejudicadas
• França 10 crianças selecionadas para terapia
  gênica células da medula óssea retrovírus
• 9/10 crianças apresentaram células T com o gene
  transduzido
• Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T
  3 anos após a terapia inserção do
  retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2
  (fator de crescimento)

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FIBROSE CÍSTICA

• gene mutante CFTR - 7q31-32 (AR)
• proteína reguladora de condutância transmembrana
  transporte de Cl- diminuído e do Na aumentado

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Fibrose Cística

• vetor adenoviral infecta os pulmões, penetra em
  células que não estão em divisão sem integrar no
  seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA
  viral, introduzido pelo nariz com um spray
• desvantagem inflamação com ataque imune que
  neutraliza as células contendo gene adenoviral
  efeito da terapia de vida curta, cerca de 6
  semanas

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TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA

• Mutação no gene do fator VIII de coagulação
• afeta 15000 homens (recessiva ligada ao X)
• Sintomas sangramento espontâneo nas juntas, nos
  tecidos moles e órgãos vitais
• Tratamento injeções regulares de fator VIII

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TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA

• 6 pacientes submetidos à terapia gênica
• Procedimento
• extração de células da pele (fibroblastos)
• inserção do gene normal em plasmídeo (não
  provocam rejeição pelo organismo)
• inseridos nos fibroblastos por choque elétrico
• clonagem dos fibroblastos
• pacientes receberam implantes dos fibroblastos no
  abdomem, após pequenas incisões
• aumento de 1 a 4 do fator VIII (melhora
  qualidade de vida dos pacientes)
• benefícios foram temporários apenas 10 meses

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VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA

• Universidade de Pensilvaniarapaz de 18 anos
  faleceu durante sua participação em uma triagem
  de TERAPIA GÊNICA
• Doença deficiência de ornitina transcarbamilase
  (OTC) doença genética ligada ao X ? distúrbio do
  ciclo da uréia (fígado) ? causa níveis impróprios
  de amônia no sangue
• Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de
  adenovírus) ? injeção no fígado ? altos níveis de
  IL-6 ? consequências sistêmicas ? síndrome de
  resposta inflamatória sistêmica letal

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TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER

• Cerca de 420 protocolos
• 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo
  envolvem cânceres não herdados
• introdução de genes supressores de tumor para
  restaurar a função perdida. Ex. inserção gene
  TP53 normal em tumores de pulmão ?bloquear a
  progressão tumoral e apoptose
• Imunoterapia introdução de lipossomos com DNA
  para HLA-B27 em melanoma expressão de HLA-B27 na
  superfície das células e destruição pelas
  células T citotóxicas ? regressão do melanoma em
  alguns casos

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TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER

• Terapia "antisense bloqueia a tradução de mRNA
  transcritos por genes tumorais (ExVEGF, c-Fos)
• Terapia pró-droga ou gene suicida transferência
  de um gene (HSV-tk) que torna as células em
  divisão sensíveis a drogas selecionadas
• Tripla hélice TFO ligam-se ao DNA duplex ?
  bloqueia expressão gênica
• Ribozima moléculas de RNA ? clivam RNA

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AS 15-20 pb ou complementar ao mRNA inteiro ?
bloqueiam os fatores de iniciação da tradução ou
interação do mRNA e ribossomos. Ex. AS
complementar ao VEGF
AS
Oligos nucleases-resistentes
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Terapia pró-droga
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TFO polipurina ou poliadenina ? ligam-se a
cadeia rica em purina no sulco principal do DNA
através de pontes de hidrogênio ? região de
regulação de transcrição gênica
TFO
Ex. TFO promotor c-Myc, H-Ras,Her-2/neu
Mudança conformacional do sulco bloqueio
interação DNA-proteína
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Ribozimas moléculas de RNA que catalizam a
clivagem sítio-específica de RNA (geralmente
sítio 3- códon GUN do mRNA)
Ex. mRNA c-fos mRNA H-Ras (mutação códon 12)
GGU?GUU
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DIFICULDADES DA TERAPIA GÊNICA

• Obtenção da alta eficiência na transferência
  gênica
• Dificuldades de atingir o tecido alvo. Ex.
  neurônios (distúrbios do SNC)
• Expressão adequada do gene transferido expressão
  transitória e de baixo nível (lt1)
• Necessidade de regulação precisa da atividade
  gênica. Ex. Talassemia
• Ocorrência de inserção casual no genoma da célula
  hospedeira

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• GRANDE DESAFIO?????
• TRAZER A TERAPIA GÊNICA À PRÁTICA
  CLÍNICA!!!!!!!!!!!!