1. dia

1
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS
GYAKORLATA Dr. Kremmer
Tibor VII. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS
MÓDSZEREK HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ
KROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM
Budapest 2013

2
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIAHYDROPHOB
IC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY(HIC)
3
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS

• 1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél
  spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos
  kölcsönhatásokat figyelnek meg
• 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography
• Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra
  alkilaminokat alkalmaz
• 1973 Hjerten Hydrophobic Interaction
  Chromatography
• Porath Hydrophobic Salting-out
  Chromatography
• Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék
  retenciója no
• Hoftsee Hydrophobic Adsorption
  Chromatography
• A ligandum szénláncának növelése és
  suruségének csökkentése növeli az eljárás
  felbontóképességét
• 1976 Morris HIC (Trends Biochem Sci.)
• 1980 - HPLC töltetek
• 5-10 ?m szemcseméret (analitikai)
• 20-40 ?m szemcseméret (preparatív),
  pórusméret növelése (300Å)
• 1986 Nem porózus töltetek (1-3 um)

4
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)
matrix
spacer
protein
ligandum
(domain)
5
(No Transcript)
6
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
(HIC) KÜLÖNBÖZO LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA
(Gooding et al. 1984)
OH-Propil ? Propil ? Benzil ? i-Propil ? Fenil ?
Pentil ? a retenció növekedése ?
7
KÜLÖNBÖZO ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB
KÖLCSÖNHATÁSRA
PO43- SO42- CH3COO- Cl- Br- NO3-
CIO4- SCN- növekvo besózó -
csökkeno kisózó hatás
növekvo kaotrop - csökkeno kozmotrop hatás
NH4 Rb K Na Cs Li Mg2 Ca2
Ba2
Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala
8
HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN
(AGP) ÉS

ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) ELVÁLASZTÁSA ÉS
TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ
KROMATOGRÁFIÁVAL Fractogel EMD Propyl oszlop
(10x1 cm, 20-40 ?m) Eluens A 20 mM Na-foszfát,
pH 7,2 1,1 M
NH4-szulfát Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH
7,2 Lineáris gradiens elúció Áramlási sebesség
1 mL/perc Detektálás 278 nm (Oláh, Kremmer,
Boldizsár, J. Chromatogr. 2000)
(NH4)2SO4 1,5 M
9
REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB
KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL
M
(NH4)2SO4
10
HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA FEHÉRJÉK
OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK
PROTEIN RRT
Cytochrome C 0.59
Myoglobin 0.73
Ribonuclease A 0.76
Haemoglobin 0.91
Albumin (human) 0.94
Ovalbumin 1.00
Trypsinogen 1.02
Transferrin 1.07
Lysozyme 1.08
Albumin (bovine serum) 1.11
a-Chymotrypsinogen A 1.12
Pepsin 1.15
Trypsin inhibitor 1.23
11
Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins
Column A Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm
ID, 2.5µm particles Column B Progel-TSK
Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 µm particles
Column C ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm
ID, 10 µm particles
Mobile Phase A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0
and 2.3 ? 0M ammonium sulfate (12 min) B - C
0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 ? 0M
ammonium sulfate (60 min) Flow rate 1mL/min
Temp. 250 C Detection UV 280 nm
Samples 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae,
3. Lysozyme, 4. ?-Chymotrypsin, 5.  ?
-Chymotrypsinogen
12
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A
FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA II. SÓK HATÁSA
A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA
1 - Kis sókoncentrációk -
ionos kölcsönhatások - stabilizálás 2 -
Nagy sókoncentrációk - speciális
kölcsönhatások, kozmotróp sópárok,
pl. (NH4)2SO4 - stabilizálás,
majd kicsapódás,
? hidrofób kölcsönhatások
13
HIC - TERVEZÉS
14
A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS FORDÍTOTT
FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA
Mindkét technikában közös és jellemzo - Az álló
fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A
szorpció oka a hidrofób (apoláris)
kölcsönhatás. - A retenciót dönto módon a
hidrofóbicitási viszonyok határozzák
meg. - Mindkét technika alkalmas a fehérjék
elválasztására.
15
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT
FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI

• - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a
  felületi koncentrációja.
• A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a
  fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a
  denaturáció esélye.
• A RPC esetében az eros szorpció megszüntetheti az
  eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót
  elsosorban az elsodleges szerkezet hidrofób
  jellege határozza meg.
• - A RPC esetében a fehérje spontán kötodik a
  ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer
  adagolása okozza.
• - A HIC esetében a fehérje kötodése a tölteten és
  a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával
  érheto el. Az elúció a só negatív koncentráció
  gradiensének eredménye.
• A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntoen
  az álló fázis (ligandum) felelos,
• a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a
  domináns tényezo

16
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A
FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA I. FEHÉRJÉK
"VIZES" KÖZEGBEN

• A fehérjék fiziológiás körülmények (pH,
  ionerosség) között harmadlagos ill. negyedleges
  szerkezettel (folded) rendelkeznek.
• A fehérjék apoláros karakteru aminosav összetevoi
  (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet
  belsejébe törekszenek, egy részük azonban a
  felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb.
  a felület 40-át képezi, és fontos funkcionális
  szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában.
• Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes
  oldatokban a víz molekulái un. "icebergs"
  formában fedik a hidrofób felületeket.
• Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób
  anyag vizes oldatban létrejövo kapcsolata során a
  víz jégszeru struktúrája mintegy feloldódik és
  dezorganizálódik (entrópia no az energia
  felszabadulás fedezi az asszociáció
  energiaigényét)
• Vizes oldatokban ezek az erok stabilizálják a
  fehérjék natív szerkezetét.
• A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben
  általában jól oldódnak (stabilak) és
• nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

17
A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A
FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA III. SÓK
HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA
Melander és Horváth (1977) SZOLVOFÓB
ELMÉLET - Az oldódás során az oldószer az
oldandó anyagot befogadó üreget (cavity)
képez. - Az oldhatóság a határfelületi
szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami
az oldószer felületi feszültségétol függ. -
Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az
oldat felületi feszültsége arányosan
változik V Vo c . R . m
R - a víz felületi feszültsége
c - a só moláris felületi feszültség
inkrementuma - c korrelációba hozható a sók
(anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888).
- Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat
számára legegyszerubb formájában a retenció
kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad.
A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a
következo egyenlettel fejezheto ki ln k
ln kviz S. m az egyenes tengelymetszete
(elvileg) a tiszta vízben mérheto kapacitási
faktor logaritmusa. - A konkrét
mérések az elmélet számos bizonytalanságára
hívják fel a figyelmet.
18
PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET Timasheff (1959)
Arakawa és Timasheff (1982)
-  Egy egyensúlyi rendszerben lévo oldathoz adott
komponens megváltoztatja a fennálló
egyensúlyt. -  Az új komponens nem egyforma
mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévo
komponensekkel (preferentíal interaction), ezt
fejezi ki a preferential interaction paraméter
(PIP). -  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai
potenciál változásának mérésével lehetséges, ez
arányos a felületi feszültség változással. - 
Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp
sók) a fehérjék környezetében negatív PIP
értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék
közelébol. Ennek eredménye egy többlet
hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját
megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet. -  A
só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás
eredoje 1. kedvezotlen felületi feszültség
változás 2. kedvezo só kötodés A kisózó szerek
esetében az elso hatás a domináns (egyértéku
kationok sói), a besózó szerek esetében a második
kompenzálja az elsot.
19
A ligandum szerkezetének szerepe az albumin
kötödésében a hidrofób kölcsönhatású
kromatográfiában
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)