Biotechnologie v

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Biotechnologie végétale

• Cultures in vitro de plantules Suspensions
  cellulaires et protoplastes Des outils pour la
  recherche fondamentale

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Exemples dutilisation en recherche fondamentale

• Cultures de plantules in vitro
• Approches pharmacologiques et toxicologiques
• Suspensions cellulaires et protoplastes
• Échanges membranaires, mécanismes signalétiques
• Adressage protéique
• Dédifférenciation, Différenciation
• Contrôle du métabolisme

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Approches pharmacologiques sur plantules

• Déterminisme hormonal de la formation de racines
  secondaires

Zhu et al.
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Utilisation des suspensions cellulaires dans un
contexte de signalisation cellulaire
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Hypersensitive Response (HR)
Interactions plantes / pathogènes
Réaction rapide
À plus long terme
HR Mort cellulaire Circonscription du pathogène
SAR Systemic Acquired Resistance
 Immunisation des plantes 
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Exemple typique infection par le virus de la
mosaïque du Tabac
3 jours dinfection
Lam et al. (2001) Nature
Nécroses mort cellulaire Restriction de la
propagation du virus
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Caractéristiques histologiques de la réaction
hypersensible
Composés phénoliques (autofluorescence)
Callose
Mort cellulaire (Bleu Evans)
H2O2
Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells
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Inconvénients du modèle plante entière

• Culture des plantes
• En serre dépendance des saisons
• Chambres de culture coûteux
• Variabilité importante
• Dosages enzymatiques difficiles
• Problèmes de pigments
• Mesures de flux difficiles
• Utilisation difficile dinhibiteurs

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Utilisation de suspensions cellulaires

• Quantification de la mort cellulaire
• Utilisation dinhibiteurs
• Petites quantités
• Rapidité dabsorption
• Facilités dextraction et dosages
• Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS, NO)
• Activités enzymatiques
• Extractions dARN

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Estimation de la mort cellulaire

• Colorants
• des cellules vivantes
• Fluoresceine diacétate
• Rouge neutre
• des cellules mortes
• Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de propidium
• Comptages sous microsope
• Comptages par fluorimétrie

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Mort cellulaire Nicotiana tabacum/ Phytophtora
cryptogea
H2O
Cryptogéine
Prélèvements et comptage de la mort cellulaire au
cours du traitement
Cryptogéine
mortalité
Témoin
heures
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Recherche dévènements précoces
Cryptogéine
mortalité
Témoin
heures
Que se passe-t-il pendant ces premières heures?
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Synthèse des composés phénoliques
Transcription du gène codant la PAL
Zhang et al. 1998 Plant Cell
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Suivi des concentrations ioniques intracellulaires

• Exemple du calcium

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Sondes calciques
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Pénétration des sondes

• Problème sondes chargées négativement,
  imperméantes
• Solution dérivation avec un groupement
  acétométhylester (AM)
• Les molécules pénètrent les cellules
• Action desterases endogènes
• Libération des formes actives dans le cytoplasme

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Inconvénients

• Sensibilité au pH
• Compartimentation ?
• Changements de pH cytoplasmique
• plus qualitatif que réellement quantitatif

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Suivi du calcium intracellulaire

• Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

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Mode daction de la coelentérazine
calcium
coelentérazine

O2
Ca2
CO2 ?469nm
apoaequorine
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Fluctuations de la concentration cytosolique de
calcium
Lecourieux et al. 2002 Plant Cell
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Elaboration dun modèle de signalisation
cellulaire
Ca2
Cry
Mort cellulaire
Phosphorylations (kinases)
NO3-
NADPH
NADP
H2O2
Modèle très simplifié dune voie de transduction
du signal entre la perception de la cryptogéine
et la mort cellulaire (Nicotiana)
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Utilisation de protoplastes en recherche

• Transport membranaire
• Adressage protéique
• Protoplastes tissu-spécifiques

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Étude de transports membranaires
Photoassimilats
Minéraux, H2O
Absorption racinaire Trafic vasculaire Relations
Source / Puit
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Étude de transports membranaires

• Problème des suspensions cellulaires
• Agrégats
• Paroi végétale
• Les protoplastes un modèle simple et pertinent

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Étude de transports membranaires

• Traceurs isotopiques
• Sondes fluorescentes
• Electrophysiologie

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Traceurs isotopiques
Incubation protoplastes 63Ni 10 µM
Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s
Ni
Ca
Ca
Ca
Ni
Ni
Ni
Ca
Ni
Filtre 0.45µM
Ni
Ni
5 mn
Comptage 63Ni dans le filtre Ni intracellulaire
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Sondes fluorescentes
Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N
(spécifique du Cd)
Lindberg et al. (2004) Planta
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Utilisation des protoplastes en électrophysiologie
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Caractérisation de canaux voltage- dépendants
Les solutés diffusent selon le gradient
électrochimique. Comment caractériser la
régulation électrique de canaux ?

• Voltage Clamp
• Patch Clamp

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Voltage Clamp
Une électrode enregistre les modifications de
tensions La seconde impose une tension et corrige
les variations
Enregistrement des courants ioniques
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Patch Clamp

• Mesure des courants sur une surface membranaire
  très réduite
• forte résistance mesure de courants faibles
• étude dun petit nombre de canaux

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Patch Clamp principes

• Imposition dun potentiel membranaire
• Mesure dun courant

100 pA
75 ms
pA
mV
Assmann (2001) Plant Physiol.
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Adressage des protéines

• Expression transitoire en protoplastes de
  protéines fusionnées avec une GFP

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Canaux et transporteurs membranaires

• Souvent faible niveau dexpression
• Fonction définie essentiellement par
• Spécificité de substrat
• Expression tissulaire
• Adressage membranaire

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Exemple dune P-ATPase
Greffage dune GFP sur une partie soluble
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Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria
Spécificité de la GFP pas de groupement
prosthétique synthétisé séparément modification
dacides aminés de la chaîne polypeptidique
Stucture  cannette de feuillets ß 
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Hexapeptide FSYGVQ
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(No Transcript)
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Expression transitoire principe

• Insérer un fragment dADN codant un protéine dans
  un protoplaste
• Plasmide
• DNA double brin ou simple brin
• Observation directe de lexpression
• Pas forcément dintégration chromosomique

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Construction HMA4GFP
Protéine de fusion
Promoteur
HMA4
GFP
2x35S
Ampi
Ori coli
Réplication et sélection dans E. coli
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Transformation de protoplaste

• Préparer de grandes quantités de plasmide
• Transformation
• MaMg
• Mannitol (0.5 M)
• MES-KOH (5 mM) pH 5,6
• MgCl2 (15 mM)
• Polyethylène Glycol
• déstabilisation de la membrane

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Transformation de protoplastes
300 µl PEG 40
30 min sur glace
0-2 C
Rinçage par dilution / sédimentation NaCl,
CaCl2, Glucose
Dans 300 µl de tampon 106 protoplastes 10 µg de
plasmide 100 µg de  DNA carrier 
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Expression

• Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri
• Incuber 4-48 heures à lobscurité

Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)
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Un transporteur du plasmalemme AtHMA4
Témoin GFP soluble
AtHMA4GFP
Verret et al. (2004) FEBS Lett.
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Un transporteur de la membrane tonoplastique
AtNRAMP3
Thomine et al. (2003) Plant J.
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Isolation de protoplastes spécifiques dune
assise tissulaire

• Gène rapporteur GFP sous le contrôle dun
  promoteur spécifique dune assise tissulaire

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Isolement de protoplastes de racines
Tri des protoplastes exprimant la GFP par
cytométrie en flux
Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.
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Les protoplastes tissu-spécifiques un outil de
recherche polyvalent

• Electrophysiologie
• Transcriptomique
• Protéomique

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Exemple transcriptome des cellules du centre
quiescent
Nawy et al. 2005 Plant Cell
Fluorescence GFP Contre marquage IP
Tri par cytométrie en flux
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Hybridation sur puces à ADN
Nawy et al. 2005 Plant Cell