BIOTECHNOLOGIE

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BIOTECHNOLOGIE
Der Schlüssel zum
21. Jahrhundert?
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie
21. Januar 2004
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Was ist Biotechnologie?
the application of scientific and engineering
principles to the processing of materials by
biological agents (Definition OECD)
Biologie
Chemie
Biotechnologie
Technik
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie
21. Januar 2004
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Biotechnologie heute
Grundlagenforschung Identifizierung von
Meeresorganismen mit biotechnologischem
Anwendungs-potenzial
Anwendungen im Gesundheitswesen
Awendungen als Alternative zur chemischen
Industrie
Biotechnologie im Agrarsektor
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie
21. Januar 2004
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Industrielle Prozesse, basierend auf
biologischen Systemen,zum Beispiel....
Bakterien
ganzen Zellen
Hefen
Pilze
isolierten Enzymen
Pflanzliche Öle
nachwachsenden Rohstoffen
Zellulose
Stärke
Katja Otto, ETHZ, Institut für Biotechnologie
21. Januar 2004
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Parameter für biotechnologische Prozesse
B.Hauer, BASF
Chemikalien Bulk Fein
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AUSWIRKUNG AUF DIE CHEMISCHE INDUSTRIE IN 2010

• Abhängig von...
• Technologie Entwicklung
• Welweite Nachfrage
• Rohstoffpreise
• Politische
• Rahmenbedingungen

2004
20
10
2010
2000
Zeit

• McKinsey Analyse Auswirkungen der Biotechnologie
  
• auf die chemische Industrie

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Welche Enzyme werden als Biokatalysatoren genutzt?
Oxidoreduktasen
Oxidation
Transferasen
Ganze Zellen
25 28
5 11
Reduktion
1 4
Isomerasen
5 12
Lyasen
Straathof, A., Panke S., Schmid A. (2002) Curr.
Opin. Biotechnol. 13, 548-556 Faber, K. (2000)
Biotransf. in Org. Synthesis, Springer 4th ed.
8
Produkte
Straathof, A., Panke S., Schmid A. (2002) Curr.
Opin. Biotechnol. 13, 548-556
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Nachhaltige Bioprozesse in der chemischen
Industrie
10
Production von 7-ACA
7 Amino Cephalosporanic Acid
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Fakten

• Prozessentwicklung von Hoechst, später gekauft
  und optimiert von Biochemie, NovartisGenerics
• Grund Zusätzliche Steuer auf Sondermüll
  (Verbrennung)
• 7-ACA spielt eine zentrale Rolle in der Synthese
  von semi-synthetischen Cephalosporinen
• Nachfrage ? 2000 t pro Jahr

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Synthese von 7-ACA
(ZnCPC)
D-AAO
TMSCI
Tlt 0oC
PCl5
spontan
Tlt 0oC
Hydrolyse
Glutaryl amidase
13
7-ACA Prozess im Überblick
Enzymproduktion E. Coli Trijonopsis variabilis
Enzym reinigung
Immobilisierung (Eupergit)
Batch Reaktor (10000L)
Produktkristallisation
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Chemisches Verfahren

• Gebrauch von N,Ndimethylanilin, (CH3)3SiCl, PCl5
  ? GIFTIG
• Schutzgasatmosphäre
• Niedrige Temperaturen lt0oC ? hoher Energieaufwand
• Aufwendige Abluftreinigung
• Aufwendige Abwasserreinigung
• Schwermetal Entsorgung (Verwendung von Zn-Salzen)

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Biotechnologischer Prozess

• Keine giftigen Chemikalien
• Keine Lösungsmittel (I)
• Raumtemperatur
• Keine zusätzliche Abwasser Reinigung
• Stark reduzierte Abluftemissionen

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Vergleich
OECD 2001
BT
Chemisch
17
Indigo
Pseudomonas putida
18
Traditionell
Indoxyl
Indigofera Blätter
Fermentation (Gärung)
Schlagen der Fermentationsbrühe
Oxidation zum Indigo
Wasserunlösliche Paste
Reduktion im Färbesud Küpe
Trocknen Rück- oxidation zum Indigo
Färben
Indigofera tinctoria
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Chemisch

• A. Baeyer 1878 (BASF)
• Heumannsches Verfahren (seit 1890)

NaNH2
Na
180-200oC KOH - NaOH

• Früher Gewinnung von N-Phenylglycin aus Anilin u.
  Chloressigsäure
• heute durch Hydrolyse von Anilinoacetonitril

O2
Indigo
20
Ensley, Ratzkin, Osslund, Simon, Wackett, Gibson
1983, Science, 222167-169
Prozessentwicklung (I)
Tryptophanase
In rekombinatem E. Coli
Naphthalen Dioxygenase
Luft
spontan
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Prozessentwicklung (II)
PROBLEME

• Niedrige Naphthalen Dioxygenase Aktivität
• Indol Konzentrationen gt400mg L-1 sind toxisch
  durch Inaktivierung des Ferredoxin Systems
• Hohe Indirubin Konzentration ? Farbstoff zu rot
• Indol und Tryptophan als Ausgangsmaterial sind zu
  teuer

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Prozessentwicklung

• Konstruktion von besseren Plasmiden mit starken
  Promotorsequenzen ? Höhere Oxygenaseaktivität in
  E. coli.
• Klonierung der Ferredoxingene ? Höhere
  Konzentration in der Zelle
• Site Directed Mutagenesis der Ferredoxingene ?
  stabileres Ferredoxin
• Einführen einer Isatin Hydrolase ? reduzierter
  Indirubin Gehalt
• Metabolic Engeneering ? Glukose als
  Ausgangsmaterial ? billig

LÖSUNG
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Indigo via moderner Biotechnologie
Bialy, Nat. Biotech. (1997) 15 110
ERGEBNIS
Glukose
Tryptophanase
Naphthalen Dioxygenase
Luft
spontan
24
Ergebniss
Genencor, USA
25
Biotechnologische Prozesse für den Umweltschutz

• Indikatorsysteme, basierend auf
  enzym-katalysierten Reaktionen
• Reinigung von kontaminierten
• Böden
• Wässern
• Luft durch Mikroorganismen

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Äussere Symptome der Arsenicosis
Haut Pigmentierung
Blackfoot Krankheit
Quelle Alexander J.B. Zehnder Jan Roelof van
der Meer, EAWAG Zusammenarbeit mit Sylvia
Daunert, Universität von Kentucky
27
Verbreitung von Arsenbelastetem Grundwasser
28
Quelle Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
Arsenresistenz in Prokaryonten
As(III)
29
Reportergen lacZ kodiert ß-Galaktosidase

• Stammt aus dem lac-Operon von E.coli
• ß-Galaktosidase spaltet X-Gal
• ?? blaue Farbe

30
Quelle Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
Entwicklung eines Arsenit Indikators
0
ArsR
LacZ
12
arsR lacZ
24
Aufgrund des Expressionsmechanismus der ars Gene,
kommt es immer zu einer Hintergrundreaktion
62 µgL-1
31
Quelle Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
Reduktion der Hintergrundreaktion
AUS
arsR lacZ
LacZ
AN
arsR lacZ
As(III)
As(III)
LacZ
LacZ
LacZ
32
Quelle Prof. Alexander J.B. Zehnder, EAWAG
Fertiges Produkt

• Lyophilisierte E. coli werden
• zusammen mit einer x-Gal
• Lösung auf die Testplättchen
• aufgebracht

• Einfach zu verwenden
• Einfach aufzubewahren
• Sehr empfindlich

• Inkubations Temperatur 30 oC
• Inkubationszeit 30 min
• Farbentwicklung 30 min

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Biologische Abluftreinigung (B-ALR)
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Ca. 15 bis 20  aller industrieller Emissionen
können durch biologische Verfahren gereinigt
werden
Beispiel Druckereiabluft
CnHn2 n-Hexan, n-Heptan
Ester Ethylacetat, 1-Propylacetat, 2-Propylacetat
Ether Methoxypropanol, Ethoxypropanol
Ketone Aceton, 2-Butanon
Alkohole Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol,2-Butanol
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Der Biowäscher
Prof. Engesser, Uni Stuttgart

• Der klassische Biowäscher besteht aus der
  Kombination zweier Verfahren

Absorption von gasförmigen Abluftstoffen in einem
Wäscher

Biologischer Abbau dieser Stoffe in einem
Belebungstank
35
Funktionsschaubild
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Belebungsbecken
36
Think Big.
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
ABLUFTREINIGUNG
BIOLOGISCHE
Sammlung Abluft
Belebungsbecken
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Füllkörper der Wascheinheit
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Polystyrolringe zur Oberflächenvergrösserung ?
besserer Übergang der gasförmigen
Abluftinhaltsstoffe in die Waschflüssigkeit
Ein Aufwuchs von Mikroorganismen ist nicht
beabsichtigt!
38
1010 bis 1011 Zellen pro ml (OD546 gt 60)hohe
morphologische Diversität
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Abbau durch MOs im Belebungsbecken
Pilzdichte 107 bis 108 KBEvor allem Hefen und
hyphenbildende Pilze
39
Biotech ? E suuberi Sach?!
Prof. Engesser, Uni Stuttgart
Clogging der Packung
Verstopfung des Gitterrosts
40
Voraussetzungen und Nachteile der BIO-ALR
Prof. Engesser, Uni Stuttgart

• Voraussetzungen
• Abluft muss richtige Temperatur haben
• Abluft muss richtige Feuchte ? haben
• Abluft muss frei von Fetten und Stäuben sein
• Nachteile / Probleme
• Schlechtes Übergangsverhalten gas / flüssig bei
  einigen Stoffen
• Keine Konvektion im Biofilm, nur Diffusion
• Aufzucht stabiler Biozönosen
• Clogging

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Vorteile
Prof. Engesser, Uni Stuttgart

• Hoher Wirkungsgrad bzgl. der erforderlichen
  Geruchsminderung.
• Dynamisches System
• Geringe Betriebskosten
• Durch den biologischen Abbau der Schadstoffe wird
  das Problem nicht von der Abluft in andere
  Kompartimente verlagert
• Es entstehen keine Sekundäremissionen

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Grüne Biotechnologie
Alle Anwendungen von Biotechno-logie im
Agrarsektor

• transgene Pflanzen mit Schädlings- oder
  Herbizidtoleranz
• transgene Pflanzen mit höheren Erträgen
• Functional Food
• Nutraceuticals

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Weltweiter Anbau von GenTechPflanzen
ISAAA
44
Transgene Nutzpflanzenein kontroverses Thema
National Center for Food Agricultural Policy
Pro

• Medizinischer Nutzen

• Schädlingsresistenzen ? Weniger Pestizide

• Lösung des Ernährungsproblem der Dritten Welt

• Signifikante Ertragssteigerung ? Einsparungen
  von Anbaufläche

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Transgene Nutzpflanzenein kontroverses Thema

• Unkontrollierten Ausbreitung ? Rückgang der
  genetischen Vielfalt
• Negative Auswirkungen auf das Ökosystem

Contra

• Unkontrollierter Gentransfer ? Entstehug von
  resistenten Schädlingen

• Angst vor negativen Auswirkungen auf den
  Menschen (z.B. Allergien)
• Deklarierungsproblematik

? Mangelnde Akzeptanz beim Endverbraucher
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Goldener Reis
Ye, X., Al-Babili, S., Kloti, A., Zhang, J.,
Lucca, P., Beyer, P., Potrykus, I. (2000),
Science, 287, 303
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Motivation
½ Mio Kinder erblinden jährlich
1-2 Mio Kinder sterben jährlich
erhöhte Infektions anfälligkeit
Vitamin A Mangel
Nacht blindheit
Xero phthalmie
Wachstums störung
500 000 Millionen Menschen sind weltweit betroffen
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Vitamin A Reis keine Liebesbeziehung
Grundnahrungsmittel für 2 Milliarden Menschen
Hoher Fettsäure- gehalt in der Schale, wenig Vit.
A
Kein Vitamin A im Endosperm
GGPP im Endosperm
49
Synthese von Vitamin A
?-Carotin (C40)
50
Methode
51
Status Quo (2001)

• Konstruktion einer tropischen Golden Rice Sorte
  mit Hilfe der gleichen Technologie
• Erhöhung der ?-Carotin Produktion durch
  klassische Selektion
• Sondierung sinnvoller Anbaugebiete
• Erhöhung der Akzeptanz in der Öffentlichkeit

52
Biotechnologie
Der
Schlüssel
zum
21. Jahrhundert?
53
Quellennachweis
http//www.europabio.orghttp//www.isaaa.org
http//www.transgen.de
http//www.degussa-foodingredients.de
http//www.cato.com/biotech
http//www.ncfap.org
http//www.oecd.org
http//www.uni-stuttgart.de/siwa/alr
http//www.eawag.ch
A. Liese, K. Seelbach, C.Wandrey, (2000)
Industrial biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim
The Application of Biotechnology to Industrial
Sustainability (2001), OECD