Prsentation PowerPoint Lhtrotrophie

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Préparation au TP
TP de 10 h Purification de la calmoduline de
feuilles de pois
POUR LE TP Apporter un marqueur à encre
indélébile (alcool pas acétone !) Une feuille de
papier millimétré Une calculette
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Il est pratiquement impossible de changer de
groupe. La seule possibilité cest de trouver
quelquun qui veuille bien échanger sa place
contre la vôtre. Attention, si vous ne respectez
pas cette règle, vous risquez de ne pas pouvoir
faire votre TP et de repassez le TP à la deuxième
sessionà lécrit uniquement
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Calmoduline  petite  protéine (154 acides
aminés en moyenne) à 2 domaines identiques
fusionnés tête-bêche
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La calmoduline (CaM) une protéine de régulation
du métabolisme dans le cytoplasme des cellules
eucaryotes
4 sites de liaison de Ca2
C-ter
N-ter
Module via le calcium (doù son nom calmoduline)
lactivité de protéines cibles en interagissant
avec elles
Ex de cible la phosphodiestérase qui hydrolyse
lAMPc AMPc H2O ?AMP
5
1
3
Forme  haltère 
Forme  pince 
2
P inactive
P active
P-Ca2-calmoduline
P Ca2 calmoduline
3
6
Forme  haltère 
Forme  pince 
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TP 3 séances - 1 semaine sur 2
Contenu des séances
1ère séance (4h) extraction des protéines
solubles de feuilles de pois et purification
de la calmoduline
2ème séance (4h) dosage des protéines dans les
fractions (brutes et purifiées) et analyse des
protéines par électrophorèse en gel de
polyacrylamide
3ème séance (2h) analyse des résultats
(rendement et facteur de purification)
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1ère séance Purification de la calmoduline en 3
étapes

• 1ère étape broyage des feuilles suivi de
  centrifugation
• S1 (protéines solubles) et C1 (protéines
  membranaires débris)
• 2ème étape chauffage de S1 à 90 C x 10 min
  suivi de centrifugation ? S2 (protéines
  thermostables) et C2 (protéines thermosensibles)
• 3ème étape chromatographie daffinité de S2 sur
  phénylsépharose ? Eluats E1 à E5

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• 2ème séance
• Dosage des protéines
• Analyse des protéines par électrophorèse

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Dosage des protéines
Les protéines peuvent être colorées à laide du
bleu de Coomassie, le réactif de Bradford (marque
BioRad). Ce composé réagit avec les résidus
hydrophobes des protéines et la coloration passe
du brun au bleu (qui absorbe à 595 nm).
Lintensité de la coloration (donc de
labsorbance) est proportionnelle à la
concentration en protéines. Lintensité de la
coloration est mesurée à laide dun
spectrophotomètre à 595 nm.
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Dosage des protéines présentes dans S1, S2 et E1
 
(Pour S1 et S2, une dilution est nécessaire)
200 µl à doser 800 µl de réactif
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Comment relier la coloration à la concentration
en protéines ? En utilisant une gamme étalon de
protéines (GE) réalisée à laide dune solution
dune protéine de référence de concentration
connue. La protéine de référence généralement
utilisée estlalbumine sérique de buf ou BSA à
une concentration connue de 100 µg/ml. Lexemple
qui suit est ARBITRAIRE. Ce ne sont pas les
valeurs de TP.
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Les tubes de GE doivent être constitués comme
ceux des essais 200 µl à doser 800 µl de
réactif GE de 0 à 20 µg dalbumine/200 µl
 
H2O (µl)
 
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4
8
12
16
20
Albumine (µg/200 µl)
Connaissant la DO des essais on peut à laide de
cette GE déterminer leur concentration en µg/tube
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A VOUS
Déterminer les concentration en protéines de S1,
S2 et E1
S1 D100 µg/200 µl? S1
µg/ml S2 D20 µg/200 µl ?
S2 µg/ml E1 D1 µg/200 µl ?
E1 µg/ml
 

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Résultats
S1 D100 µg/200 µl? S1
1700 µg/ml S2 D20 µg/200 µl ?
S2 240 µg/ml E1 D1 µg/200 µl ?
E1 22 µg/ml
 
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Principe et calcul du rendement (Rdt) et du
facteur et de purification (F)
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Étapes de purification
450 mg
0,25 mg
F Enrichissement de 1800 fois
Au cours de la purification F doit augmenter
Le rendement est lié à la proportion de la
protéine dintérêt parmi lensemble des protéines
de départ et à lefficacité des étapes de
purification Rdt 0,25/450 x 100 0,06
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A VOUS Calculer Rdt et F avec les valeurs
fictives suivantes
PT quantité TOTALE de protéines à chaque étape
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Résultats
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Electrophorèse en gel de polyacrylamide
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Protéine (ex 1 homodimère)
Traitement des échantillons
SDS (sodium dodécylsulfate) un détergentpour
- dénaturer les protéines et les dérouler - les
convertir en polyanions
2 polypeptides constitutifs
Glycérol pour alourdir léchantillon ? au fond
du puits de dépôtBleu de bromophénol pour
suivre la migration (front de migration)
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M
E
-
Gel de concentration 4,5
Protéines de référence marqueurs (M)
Echantillon à analyser (E)
Gel de séparation 15

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On peut déterminer la masse molaire (MM) de la
protéine dans léchantillon grâce aux protéines
de référence de tailles connues. En effet, la
distance de migration dun polypeptide est
inversement proportionnelle au Log de sa
MM. Autrement dit la représentation distance de
migration f(Log MM) est une droite de pente
négative.
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(No Transcript)