Diapositive 1

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Transfection CaPO4 101 Dave Bélanger
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Théorie Mécanisme inconnu

• Hypothèses
• Le précipité formé par le CaCl2 et lADN est
  endocytosé par la cellule et lADN est ensuite
  dirigé vers le noyau (Maniatis Tome 3 p16.32).
• Le CaCl2 sionise en solution. Les ions Ca2
  générés déstabilisent léquilibre ionique au
  pourtour de la cellule et ces derniers traversent
  la membrane par osmose. Les pompes calciques
  fonctionnent alors à plein régime pour évacuer le
  Ca2 intracellulaire. Se faisant, il se pourrait
  que la cellules soit plus permissives à lentrée
  de plasmides(par exemple) soit par endocytose ou
  directement via la pompe calcique.
  (http//www.madsci.org/posts/archives/feb2000/9509
  02447.Cb.r.html)
• Le déséquilibre des ions Ca2(intra-et
  extracelulaire) pourrait aussi créer un
  changement de voltage à la membrane cellulaire,
  ce qui rendrait la cellule plus perméable.
  (http//www.madsci.org/posts/archives/feb2000/9509
  02447.Cb.r.html)

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Protocole 1- La veille, ensemencer les 293T
(250 000 cellules /puit 6p) (2x106 cellules
/ T75) 2- Retirer le milieu des cellules et
ajouter 2ml/puit 6p 9ml/T75 3-
Préparer les mélanges 1 puit 6p 1 T75 x
ul H2O x ul H2O 12.4
ul CaCl2 62.5 ul CaCl2 6ug ADN 30-40 ug
ADN 100 ul 500ul 4- Distribuer goutte à
goutte le mélange ci-dessus dans un volume égal
de HBS 2X (En injectant de lair dans le HBS
avec un pipet-aid ou en vortexant légèrement)
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Protocole (suite) 5- Laisser reposer environ
20 minutes à température pièce. 6- Confirmer
visuellement labsence de gros précipité blanc
dans le tube. Sil y en a, jeter. Le
précipité doit être minuscule. 7- Distribuer
goutte à goutte sur les cellules. 8- Incuber à
37C 5 CO2. 9- Après de 6h à 24h, laver 2 fois
au PBS et mettre du milieu frais. 10- Récolter
48h post-transfection
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Sources de problème Solution (75
du temps) ADN (20 du temps)
Cellules (5 du temps) Manipulation (ça
arrive)
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Solutions
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Solutions
HBS 2X 280mM NaCl (Fisher) 1.6g 10mM KCl
(Fisher lot 006245) 0.075g 1.5mM NaH2PO4 (MAT
lot 2834A) 0.021g 12mM Dextrose (Fisher lot
000199A) 0.2g 50mM HEPES (JT Baker lot
A01650) 1.2g 100 ml Ajuster pH entre 7.06
et 7.12 avec NaOH (avant et après avoir complété
à 100 ml) Filtrer 0.22um, aliquoter, congeler à
-20C
CaCl2 2M CaCl2 2 H20 (Fisher lot
016952) 5.88g 20 ml Filtrer 0.22mm,
aliquoter, garder à 4C
H20 Prendre la même eau que celle utilisée pour
faire les solutions ci-haut, filtrer 0.22mm,
garder à 4C
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Solutions (suite)

1. Le pH est le facteur le plus crucial. Avant de
   lajuster, calibrer le pH-mètre
2. avec les 3 solutions étalons et changer le KCl de
   lélectrode.
3. Lajustement doit se faire au centième près, de
   façon précise et exacte.
4. (pH à confirmer)
5. Utiliser toujours les même poudres (vérifier les
   numéros de lots)
6. Éviter les cycles gel-dégel pour le HBS
7. Expiration des solutions environ 6 mois à -20C

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ADN
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ADN

1. Purification QIAGEN Le kit de Sigma peut être
   bon mais semble présenter plus de variabilité.
2. De 3 à 5 ug dADN par ml (3ug/ml est amplement
   suffisant pour Nl4-3wt).
3. Un ADN visqueux est lindice dune trop grande
   concentration. Il est préférable de le diluer et
   le doser de nouveau pour avoir une distribution
   uniforme de lADN en solution.
4. Éviter de vortexer lADN. Up/down avec un embout
   est préférable.
5. Lanalyse sur gel est important afin de
   déterminer la qualité de lADN. (Dégradation,
   présence de dADN génomique, bande inexpliquée)

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Analyse sur gel
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Cellules
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Cellules En culture Maintenir à une confluence
acceptable (Max 80) Passage maximal
à déterminer Ensemencement En T75,
400 000 cellules par flasque le vendredi
donne un flasque à 60 le lundi.
Lors de la transfection Entre 25 et 50 de
confluence. 6 puits Ensemencer 250
000 cellules/puit la veille
T-75 Ensemencer 2x106 cellules/flasque la
veille
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Cellules trop compactées
Cause possible Mauvais étalage suite à
lensemencement, combiné à une
attente trop longue entre les passages Cellules
ensemencées à trop faible densité
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Croissance en 3 dimensions
Cause possible Mauvais bris des liens
inter-cellulaires suite à la trypsination
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Surconfluence
Malgré lapparence dun 85-90 de confluence,
beaucoup de cellules se sont détachées et
flottent Signe de surconfluence
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Cause possible
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Évaluer la confluence
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40
25
20
85
50
65
100
20
Prêtes à la transfection
Limite supérieure acceptable
Limite inférieure acceptable
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Manipulations
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Manipulations

1. Vortex et ADN ne font pas bon ménage
2. Température des solutions (Température pièce)
3. Incubateur à 5 CO2
4. Mélange Calcium-HBS 1/10 du volume final (ex 1
   ml dans 10 ml pour T-75)
5. Gros précipité
6. Mélange trop rapide de ADN-CaCl2 et HBS provoque
   formation rapide du précipité ce qui le rend
   trop gros et impropre à une transfection
   efficace.
7. Gros ADN ou trop grande concentration
8. pH des solutions

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Ça marche aussi Transfection le matin, laver 6
heures après. En 6 puit, transfecter dans 1 ml
au lieu de 2ml nécessite moins de réactifs
et est aussi efficace. Chloroquine
Prévient la dégradation de lADN par le
lysosome Mettre 100 mM final
pendant la transfection et laver après
3 à 6 heures
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Nouveauté Cellules 293T dégelé par lassistant
de recherche Nouvelle boite Production virale
contient les plasmides Solutions HBS et CaCl2
fabriquées maison