Diapositive 1

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BIO6031/BIA3020 Méthodologie Biochimique
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Objectifs de la réunion- Liens WEB et
références- Révision de notions de base-
Acides aminés et propriétés des protéines.-
Extraction de protéines et purification-
Caractérisation enzymatique
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http//www.bio.uqam.ca/etude1cycle.htm Lien
Méthodologie biochimique BIO6031-BIA3020
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ÉVALUATION PROTOCOLE 25 TRAVAIL EN
LABORATOIRE 25 RAPPORT FINAL 50
Évaluation individuelle
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• RÉFÉRENCES UTILES
• La version électronique du Recueil d'exercices
  de biochimie est disponible en version
  électronique (sans les questions) au lien
  suivant  http//www.bio.uqam.ca/etude1cycle.htm
  en cliquant à droite de la page sur
• Site dexercice  (Biochimie - Biologie
  végétale). Des copies du recueil
• dexercice sont à la réserve de la bibliothèque
  au nom de Mario Houde.
• Le cours préparatoire et le protocole (sans les
  articles de références) sont disponibles en
  cliquant à droite de la page sur le lien 
• Méthodologie Biochimique BIO6031-BIA3020
• Préparation BIO6031-BIA3020
• Protocole de laboratoire BIO6031-BIA3020
• Les articles seront disponibles à la COOP dici
  la fin janvier.
• Autres références importantes
• Voet Voet. 1998 (ou édition 2005 en français).
  Biochemistry
• - Chap. 5 (Purification des protéines)
• - Chap. 12-14 (Enzymologie)
• Pelmont, J. 1998. Les enzymes. (enzymologie,
  dénaturation thermique).
• Methods in enzymology. Vol. 182 (1990). Rôle et
  choix des substances à mettre dans les tampons
  lors de lextraction de protéines.
• Dey, P.M. J.B. Harbone. 1997. Plant
  biochemistry. A.P. pp. 24-30. Préparation de
  tampons

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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LES ACIDES AMINÉS

• La charge des protéines dépend des acides aminés
  (groupements R) et du pH du milieu
• - Groupements acides
• Groupements basiques
• Les groupements R peuvent aussi avoir une nature
  hydrophobe

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Extraction des protéines
Plusieurs méthodes sont possibles pour
solubiliser différentes protéines (voir les
divers articles) IMPORTANT Conditions pour
sassurer de la stabilité des protéines  pH Tempé
rature Force ionique Protéases Oxydation (ponts
disulfures) Phénols etc. Le choix du tampon doit
donc se faire en fonction de certaines propriétés
connues des protéines que lon désire purifier
ainsi que de la source de matériel (riche en
composés pouvant nuire à lextraction ou la
purification). Voir Methods in enzymology (cf
diapo 5).
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Solubilité des protéines - Effet du sel -
Effet du pH
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Précipitation fractionnée de protéines
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pH, pI et solubilité (salting in)
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TABLE DE SATURATION EN SULFATE D'AMMONIUM À 0C
Quantité de sulfate d'ammonium en grammes à
ajouter à 100 mL de solution CONCENTRATION
FINALE EN SEL ( DE SATURATION)
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La dialyse
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Précipitation fractionnée à lacétone
- La présence dun solvant organique diminue la
constante diélectrique de leau - Les protéines
chargées ont alors tendance à interagir et à
sagréger - Les protéines hydrophobes resteront
plus facilement en solution
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La chromatographie sur colonne
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Supports chromatographique
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Chromatographie par échange dions
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Chromatographie avec gradient ionique continu
A) Chargement. B) Lavage avec tampon. La
protéine 1 est non liée et éliminée au lavage C
et D) Élution par gradient continu de sel. La
protéine 2 élue en premier suivie de la protéine
3 à plus forte concentration de sel.
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(No Transcript)
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Chromatographie dhydrophobicité
Au lieu de groupements chargés, les résines
comportent des groupement hydrophobes non
polaires Phényle, Ter-butyle. Pour exploiter le
caractère hydrophobe des protéines, les charges
doivent être partiellement masquées par du
sel. La chromatographie débute donc avec une
forte concentration de sel dans léchantillon
pour favoriser les interactions
hydrophobes Après lavage en présence de sel, la
concentration en sel est diminuée au cours de
lélution (gradient décroissant de sel). Pour
des protéines très hydrophobes il faut parfois
ajouter un solvant moins polaire que leau tel
léthylène glycol
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Chromatographie par filtration sur gel
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(No Transcript)
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Poids moléculaire natif
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Chromatographie daffinité
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Électrophorèse
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Matrice dacrylamide
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(No Transcript)
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Poids moléculaire de sous-unités de protéines
(en présence de ß-mercaptoéthanol et de SDS)
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Transfert pour immunodétection ( immunobuvardage)
- Par capillarité - Par électrophorèse
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Cinétique enzymatique
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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pH optimal
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(No Transcript)
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Température optimale
100
d e l o p t i m u m
Optimum
Dénaturation Le coefficient de dénaturation
thermique est déterminé pour une Température
entre 0 et 10oC de T optimale
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Coefficient de dénaturation thermique
Graphique de log U en fonction du temps Uo
C pente de la ou des droites (si la droite est
brisée 2 isoformes)
A
Pour lisoforme B, C -0,0078 min-1
a
B
N.B. Lenzyme seul est incubé à la température
de dénaturation. Uo est lactivité avant
dénaturation Lactivité enzymatique résiduelle
(U) est mesurée après chaque temps
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(No Transcript)
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Équation de Michaelis-Menten
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Énergie dactivation
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Équation dArrhenius et sa transformation
Équation dArrhenius
Forme linéaire
Forme intégrée
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Dun point de vue pratique, les Vmax app. peuvent
remplacer les constantes k2 et k1
Vmax 2 est déterminé à la température T2 en
variant la concentration de substrat Vmax 1 est
déterminé à la température T1 en variant la
concentration de substrat
Ea peut alors être déterminé en réorganisant
léquation intégrée et en remplaçant les
différents termes obtenus
Ea 2.3 R T2T1 X log Vmax2 T2-T1
Vmax1
La méthode graphique peut aussi être employée.
Les Vmax (ou Vo à forte concentration de
substrat) sont alors utilisés. La pente de la
droite permet de calculer Ea où
Pente - Ea 2.3R
N.B. R 1.987 Cal/mol/K ou 8.284 J/mol/K
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Graphique dArrhenius
Log Vmax App
Dénaturation
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Préparation du protocole de laboratoire