Diapositive 1

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CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES
CELLULAIRES Exemple des pesticides
Laurence Gamet-Payrastre
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plan

• Généralités (définition, classification, DJA,
  LMR, expositions)
• Des facteurs de risque pour la santé chez lhomme
• Les cibles cellulaires
• Les approches en toxicologie cellulaire et
  moléculaire

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Les pesticides généralités

• ? Définition
• toute substance naturelle ou de synthèse capable
  de contrôler, repousser ou détruire des
  organismes vivants ou de sopposer à leur
  développement. Produits phytosanitaires destinés
  à un usage agricole ou non agricole
• ? Classification selon leur activité biologique
• - les insecticides
• - les fongicides
• -les herbicides
• - les divers (nématicides, rodenticides,
  taupicides, etc)
• ? Classification par famille chimique
• - Composés organiques chlorés (DDT, Lindane,
  Aldrine, Dieldrine, etc.)
• - Composés organiques phosphorés (Parathion,
  Fenthion)
• - Composés organométalliques (Dérivés de
  lurée, carbamates, etc.) 
• - pyréthrinoides de synthèse, triazine etc. "

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Les pesticides généralités
Les procédures d'évaluation du risque
- Tous les produits phytosanitaires sont soumis à
une Autorisation de Mise sur le Marché - Les
études toxicologiques et écotoxicologiques sont
réalisées par lindustriel - Lanalyse du
dossier toxicologique est assurée par des experts
indépendants, nommés dans différentes commissions
Evaluation du risque Dose journalière
admissible DJA Limite maximale de résidus LMR
Persistance
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Les pesticides généralités

• ? Les limites maximales de résidus (LMRs en
  mg/kg) dans les denrées sont établies par couple
  "matière active-denrée" à partir des données
  toxicologiques et agronomiques. Elles reflètent
  les bonnes pratiques agricoles (utilisation des
  quantités minimales nécessaires pour protéger
  efficacement les cultures), qui aboutissent à des
  niveaux de résidus acceptables, c'est-à-dire sans
  effet sur la santé.
• ? La dose journalière admissible (DJA en
  mg/kg/j) pour lhomme est déterminée pour chaque
  substance active retenue, la quantité maximale
  de produit pouvant être absorbée quotidiennement
  par lhomme au cours de toute sa vie, sans
  apparition deffet quelconque. Pour cela, on se
  base sur une dose sans effet (DSE) tirée détudes
  toxicologiques menées sur des animaux (dans le
  cadre du dossier dhomologation).

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Les pesticides généralités
dose journalière acceptable (DJA) limite maximale
de résidu (LMR)
Effet toxique
dose
Pas deffet toxique
Zone de toxicité
Dose sans effet DSE
Dose toxique
DSE (pour lanimal)
DJA (mg/kg/jour chez lhomme)
LMR (aliment, mg/kg)
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Les pesticides généralités
Persistance

• Généralement appréciée en calculant la demi-vie
  du composé, c'est-à-dire le temps nécessaire pour
  que disparaisse la moitié de la quantité (ou de
  la concentration) de résidus présents dans le
  milieu (ou l'organisme)

La persistence dun composé dépend aussi du type
de sol
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Les pesticides généralités
règlementations sévères

• Les plans de contrôle sont plus nombreux et
  mieux organisés
• Les agriculteurs sont mieux informés et formés
• Interdiction des substances les plus dangereuses
• Les tonnages utilisés tendent à diminuer
• - Réduction de moitié du nombre de substances
  homologuées
• (800 en 1990 489 en 2005) 2600 préparations
  commerciales

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Les pesticides généralités

• Usage agricole (90)
• - 3 ième consommateur mondial de pesticides
• - 4 ième utilisateur européen (par hectare de
  surface cultivée )
• Usage non agricole (10)
• - traitement des parasites dans la maison
• - traitement des bois et textiles
• - soins des animaux
• - traitement des plantes dintérieurs, jardins,
  espaces verts

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Les pesticides généralités

• Exposition professionnelle
• 1.3 millions de personnes professionnellement
  exposées en France
• X2 avec les retraités

• Exposition non professionnelle
• La population en générale

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Exposition via lenvironnement et lalimentation
Pesticides généralités
Transfert (absorption, volatilisation) vers eau
de surface, air, sols (eaux profondes) Rétention D
égradation

• EAUX
• 332 pesticides détectés entre 2001 et 2003 dans
  les eaux de distribution, de surface et
  souterraines
• sauf les eaux montagneuses
• - 9 familles chimiques différentes mais surtout
  les triazines (herbicide)
• recherche limitée par les seuils de détection
• quelques dépassement ponctuel de la LMR
  (triazine, urée substituée (diuron) et
  organochlorés)
• augmentation de la présence de métabolites de
  pesticides (DEA/atrazine)

• AIR
• - Aucune norme pour réglementer les teneurs en
  pesticides dans lair ambiant
• Associations agrées de la qualité de lair
  (AASQA)
• présence de pesticides à la fois dans lair
  urbain ou rural (Folpel (fongicide vigne)

SOLS - Pas de dispositif de surveillance pour
caractériser la contamination diffuse des sols
par les pesticides
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les aliments
Les pesticides généralités
Selon lOMS, pour les non professionnels la
principale source dexposition - alimentation
80 - eau 10
Commission des Communautés Européennes Recherche
de 500 substances actives dans 47 500 échantillons

• Direction Générale Concurrence Consommation et
  Répression des Fraudes (DGCCRFF 2003)
• ?Très peu de non- conformité pour les denrées
  animales
• ? Parmi les fruits et légumes étudiés (3000
  échantillons, 236 pesticides)
• - 50 ne porte pas de résidus des pesticides
  recherchés.
• - 44 contiennent des résidus avec une valeur
  ltLMR
• 6.6 contiennent des résidus avec une valeur gtLMR
• 23.7 contiennent plusieurs résidus

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Les pesticides généralités
Pour le consommateur Exposition chronique à de
faibles doses de pesticides en mélange
salade 6 pesticides différents poisson 3
tomates 5 blé 5 Vin 5 Produits laitiers
3 Fraises 4 pommes 3 Poivrons 8 Etc..
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Les pesticides des facteurs de risques

• Études épidémiologiques dans les populations
  exposées

• Lexposition professionnelle aux pesticides, et
  en particulier chez les agriculteurs, est souvent
  corrélée à un risque accru de pathologies graves
  comme 
• - certains cancers (hématopoïétique, cerveau,
  prostate)
• - certaines maladies neuro-dégénératives comme
  la maladie de Parkinson
• certaines déficiences au niveau du développement
  cérébral
• Des troubles de limmunité
• Des troubles de la reproduction
• Des perturbations endocriniennes

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Les pesticides des facteurs de risques
Effet de l exposition professionnelle des
parents sur la santé des enfants
Exposition professionnelle des parents seraient
associées à diverses pathologies chez les enfants

• Les cancers hématopoïétiques sont avec les
  tumeurs du cerveau, les cancers les plus
  fréquemment retrouvés chez les enfants dans les
  populations exposées .
• La survenue dautres types de cancers (tumeurs
  cérébrales, tumeurs germinales) ou des troubles
  au niveau du système nerveux central
  (développement cérébral, neuro-comportement) ou
  de limmunité ont été rapportés.

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Les pesticides des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables dinduire in
vitro dans des cellules humaines des
perturbations du fonctionnement cellulaire
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Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
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Cibles cellulaires des pesticides
la génotoxicité

• Dans les lymphocytes dagriculteurs on observe
  une augmentation des cassures simples et doubles
  brins de lADN (MN) (Tope A. et al, 2006)
• Augmentation des adduits à lADN dans le sang
  périphériques des agriculteurs (J. Le Goff,
  ,2005)
• Dans les cellules fibroblastiques de rat le
  mancozeb (fongicide, dithiocarbamate) induit des
  cassures simples brins après une heure
  dexposition à de faibles doses (Calviello G., et
  al, 2005).
• Oxydation de la lADN dans le foie de rat (8
  oxoDg) après traitement des animaux avec un
  mélange de 15 pesticides (0.75 à 10 mg/kg) (M.
  Lodovici et al, 1994)

• Les différents dommages à lADN sont les bases
  oxydées (8oxodG),
• les coupures simples et doubles brins,
• les adduits à lADN

REPARATION ADN Ralentissement du cycle
cellulaire Système dexcision et réparation des
dommages Système enzymatique de réparations des
cassures
30 000 lésions spontanées / jour/ cellule
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Cibles cellulaires des pesticides
Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc
la transcription de gènes importants ils peuvent
conduire à des mutations qui affecteront la
survie ou la capacité de prolifération des
cellules.

Accumulation danomalies génétiques définitives
dans des gènes contrôlant la survie et la
prolifération Initiation
Conséquence de la génotoxicité des pesticides ?
Cellule transformée
Stimulation de la prolifération de la cellule
transformée Promotion
tumeur
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Cibles cellulaires des pesticidesconséquence de
la génotoxicité apoptose
Ex Mancozeb induit une génotoxicité dans les
cellules fibroblastiques de rat en culture qui
conduit à linduction de la mort cellulaire
programmée (Calviello et al, 2005)
tumeur
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mort cellulaire programmée apoptose
Cibles cellulaires des pesticidesconséquence de
la génotoxicité apoptose
Processus physiologique de régulation du nombre
de cellules Au cours du développement
embryonnaire, Dans la défense immunitaire
Pour le renouvellement des cellules du
tractus digestif
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Le phénomène d'apoptose  mort cellulaire
programmée  modifications structurales

• Plusieurs étapes en cascade, dont les effets sont
  visualisables dans les cellules
• flip-flop de la phosphatidyl-sérine du feuillet
  cytosolique au feuillet extracellulaire de la
  membrane plasmique
• Boursouflure membranaire
• fragmentation de l'ADN nucléaire
• fragmentation du cytoplasme , formation des corps
  apoptotiques

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Cibles cellulaires des pesticidesconséquence de
la génotoxicité apoptose
Apoptose Modifications biochimiques
Ex le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial
transmembranaire des cellules leucémiques EL4
T, induit la libération du cytochrome c dans le
cytosol et lactivation conséquentes des
caspases (Saleh AM et al, 2003) Ex le paraquat
dichloride, un herbicide, induit lapoptose via
linduction de P53 (Takeyama N, et al, 2004)

APAF-1  apoptosis protease activating factor-1 
CAD  caspase-activated internucleosomal DNAse 
IAP  inhibitors of apoptosis proteases  PARP 
poly(ADP-ribose) polymerase  pro-CASP-9 
précurseur inactif de la caspase initiatrice
CASP-9.
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la génotoxicité dun xénobiotique peut être due à
son pouvoir pro-oxydant qui conduit à une
variation du statut oxydo-réducteur de la cellule
Cibles cellulaires des pesticides
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Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur définition
Radicaux primaires dérivent de loxygène (OH.,
O2., NO.) jouent un rôle cellulaire dans
défense, cycle cellulaire, différenciation, mort
cellulaire, transduction des signaux
Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion
peroxydase) glutathion Anti-oxydants vit E, C
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Exemple deffet pro-oxydant des pesticides
Cibles cellulaires des pesticides

• La vinclozoline ou liprodione (fongicide)
  diminue le taux de glutathion intracellulaire, et
  augmente le taux de radicaux libres dans les
  cellules HepG2 après une heure de traitement à
  25 ou 100µg/ml. Radice S et al, 1998.
• Dans les follicules ovariens isolés, le
  methoxychlore entraine une diminution des
  activités enzymatiques régulant le statut
  oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde
  dismutase) et modifie lactivité respiratoire des
  mitochondries. Gupta RK et al, 2006
• Le malathion (OP) inhibe lactivité des enzymes
  de régulation du stress oxydant , diminue la
  production dATP et altère la matrice
  mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006.
• Le traitement des rats avec du chlorpyrifos
  (insecticide, OP) conduit à une diminution des
  activité des enzymes du type SOD, catalase, à une
  déplétion en glutathion intracellulaire dans le
  foie , le rein et le cerveau des animaux traités
  avec 100mg/kg (forte dose). Verma RS et al,
  2007.
• Lalachlore et le chlorpyrifos (insecticides),
  induisent in vitro (cellules PC12 neuronales) un
  stress oxydant conduisant à une peroxydation
  lipidique, des cassures simples et double brins
  de lADN, ainsi quà une induction de protéine
  heat shock. Bagchi D., et al, 1996

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Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
La transduction du signal
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Cibles cellulaires des pesticides
La transduction du signal
Tout processus qui convertit un type de signal ou
un stimulus vers une réponse cellulaire via une
succession dévènements biochimiques (de
phosphorylation et de déphosphorylation) dans
lesquels interviennent de nombreuses enzymes
(kinase/phosphatase)

• La transduction du signal peut se faire soit via
• La liaison de molécules sur des récepteurs
  membranaires ou intracellulaires
• Un stimulus  physique  (lumière/cellules de la
  rétine)
• L interaction directe dune molécule
  (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la
  signalisation

La phosphorylation et la déphosphorylation
modulent l'activité de certains facteurs de
transcription en les activant directement
(exemple facteur AP-1) en modifiant leur
localisation cellulaire (exemple facteurs NFkB
et NFAT)
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Cibles cellulaires des pesticides
Ex Le glyphosate, un herbicide, retarde
lactivation du complexe CDK1/cycline B (Marc J,
et val, 2001) Ex Lendosulfan, la dieldrine
active la voie des MAP kinases (ERK1 et 2).
Bulayeva NN et al, 2004 EX les pesticides
organochlorés (endosulfan, lindane) active la
voie des MAP kinases (raf MEK et ERK)
ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et
al, 2005.
Les intermédiaires
30
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Statut oxydo-réducteur
Transduction du signal
la génotoxicité
Toxicologie cellulaire et moléculaire Les
approches
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Estimation de la viabilité
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

• MTT sels de tetrazolium converti par les
  deshydrogenases mitochondriales actives en
  formazan (absorbance 570nm)
• Comptage cellulaire comptage des cellules
  flottant dans le milieu de culture et comptage
  des cellules adhérentes

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Génotoxicité
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

• I Comet assay
• mesure des cassures induites
• directement par un agent génotoxique,
• indirectement lors des processus enzymatiques de
  réparation des dommages
• lors de processus secondaires de fragmentation
  de lADN tel que lapoptose.

- Principe électrophorèse en gel dagarose de
noyaux marqués avec un agent fluorescent.
33
Génotoxicité
les noyaux dont lADN a subi des cassures
prennent une forme de comète et les noyaux dont
lADN nest pas endommagé restent ronds
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Génotoxicité
Taux de mutation du gène HPRT (hypoxanthine
phosphoribosyltransferase) Voie de recyclage des
nucléotides puriques à partir dhypoxanthine et
guanine (ou de ses analogues) La perte de ces
fonctions (mutation inactivante du gène) permet
aux cellules de proliférer en présence de
6-Thioguanine
HPRT normal 6-thioguanine ? cytotoxicité HPRT
muté 6-thioguanine ? croissance normale
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Stress oxydant
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes
  réactives avec les radicaux libres
• Mesure de lactivité des enzymes régulant le
  stress oxydant
• - SuperOxyde Dismutase (SOD) 2 O2 2 H?2 H2O2
  O2
• - Catalase 2H2O2? 2 H2O O2
• - Glutathion peroxydase H2O2 2 GSH? 2 H2O
  GS-SG
• Dosage des taux de glutathion
• Dosage des marqueurs périphérique doxydation
  (8oxodg dans le plasma détection des bases ou
  nucléotides modifiés par chromatographie liquide
  haute perf. (HPLC) Spectrométrie de masse (MS)
• marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique
  (HNE (4-hydroxy -2-nonenal MDA
  malonyldialdehyde) utilisation danticorps

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Signalisation cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

• Western blot migration de protéines dans un
  gel dénaturant en fonction de leur poids
  moléculaires identifier une protéine spécifique
  dans un extrait cellulaire

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Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire signalisation cellulaire

• Arrays (Protein) antibody-array visualiser et
  quantifier lexpression de plusieurs protéines
  dun même extrait cellulaire

Plateforme Biopuces Génopôle Toulouse Midi
Pyrénées
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Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire apoptose
Cytométrie en flux

• Incorporation de iodure de propidium
• dans les noyaux et analyse de la quantité de
• fluorescence qui est le reflet de la quantité
  dADN

Double marquage iodure de propidium/
lanexine-fluorescéine Dans les cellules
apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires
sont à lextérieur et peuvent fixer lanexine.
Les membranes ne sont pas perforées et liodure
de propidium ne pénètre pas .
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Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire apoptose

• TUNEL
• Terminal deoxynucleotidyl transferase
• dUTP nick end labeling
• Détection des fragments dADN
• en marquant lextrémité terminal
• des acides nucléiques avec un
• dUTP qui sera ensuite identifié
• par un marquage fluorescent
• DNA Ladder
• migration de lADN sur gel dagarose.
• Il apparaitra sous forme de petit
• fragments (échelle) le long du gel dans le
• cas de cellules apoptotiques sinon on ne
• voit quune seule bande.

Cells containing DNA strand nicks characteristic
of apoptosis are detected by TUNEL and fluoresce
green, while necrotic cells are stained with
red-fluorescent propidium iodide
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Mesure de lactivité des caspases effectrices (3)
Approches en toxicologie cellulaire et
moléculaire apoptose
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conclusion

• Les pesticides affectent différentes cibles qui
  contrôlent la croissance et la survie des
  cellules.
• Ces effets sont observés pour des molécules
  testées individuellement
• Quen est-il de leffet des mélanges et des
  faibles doses

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Laurence Gamet-Payrastre
lpayrast_at_toulouse.inra.fr
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• les homologues Bcl-2 influencent notamment
  lintégrité des mitochondries et régissent ainsi
  la formation de lapoptosome.
• Les homologues suppresseurs (anti-apoptotiques)
  dapoptose
• peuvent lier et séquestrer APAF-1, et inhiber les
  homologues activateurs (pro-apoptotiques)susceptib
  les de provoquer louverture de pores dans la
  membrane mitochondriale  cette ouverture, quand
  elle intervient, entraîne la libération du
  cytochrome c et des inhibiteurs dIAP
• dans le cytosol.
• Dautres homologues pro-apoptotiques, dits
  sensibilisateurs, ont pour fonction
• dinhiber les homologues anti-apoptotiques 
  certains dentre eux interagissent également avec
  des activateurs pour potentialiser les fonctions
  de ces derniers. Le facteur APAF-1 et le
  cytochromec peuvent alors coopérer pour dimériser
  la pro-CASP-9, formant ainsi lapoptosome et la
  mettant aussitôt en activation. Il sensuivra une
  cascade amplificatrice dactivation de caspases
  effectrices.

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Génotoxicité

• Test des micronoyaux
• cytokinesis-block micronucleus(CBMN ) dans les
  lymphocytes humains
• Examens les noyaux interphasiques de lymphocytes
  exposés à des substances génotoxiques, après une
  culture cellulaire et l'obtention de lymphocytes
  binucléés
• - estimation des cassures
• - perte de chromosomes
• FISH fluorescent in situ hybridization
  réarrangements chromosomiques