Diapositive 1

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La F1F0 -ATPase comme cible de criblage en
levure pour la recherche de molécules utilisables
en traitement des maladies mitochondriales
Elodie Couplan
Equipes partenaires
Marc Blondel INSERM U613 Faculté de Médecine et
des Sciences de la Santé BREST
Jean-Paul di Rago Institut de Biochimie et
Génétique Cellulaires CNRS/Université
Bordeaux2 UMR5095 BORDEAUX
Financement ANR Maladies Rares 2006 AFM 2008
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Maladies mitochondriales F1F0 ATPase ?
NARP Modèle Levure Mutants NARP (F1F0
ATPase) Criblage des molécules
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La mitochondrie Un organite essentiel
Organite ubiquitaire spécifique des cellules
eucaryotes  Centrale énergétique de la
cellule  ? production dATP Sous-produit du
métabolisme mitochondrial ? production despèce
réactives de loxygène ou ROS
O2
ATP
Chaîne respiratoire
ATP synthase
4
(No Transcript)
5
Défauts bioénergétiques
Dommages oxydatifs
6
Maladies mitochondriales
Maladies génétiques  rares  affectant les
mitochondries
H
H
4 complexes respiratoires
F0
F1
O2
H2O
ATP
ADP
ATP synthase
Chaîne respiratoire
7
Maladies mitochondriales
Maladies génétiques  rares  affectant les
mitochondries origine nucléaire origine
mitochondriale
Maladies hétérogènes organes les plus
affectés (cerveau, muscles) Besoins O2 et ATP
élevés Pas de traitement efficace à ce jour
BUT ? Recherche de molécules thérapeutiques -
Maladie mitochondriale NARP - Modèle levure
8
Nucleus
ATP synthase deficiencies
14 subunits
Cytosol
TOM
OM
IMS
TIM
IM
6
8
9
9
9
9
9
i,f
Matrix
d
e
4
14 subunits
nuclear origin (defects in assembly)
g
ASSEMBLY
Atp6p, Atp8p
a
b
d
a
b
h
oscp
NARP has a mitochondrial origin (point
mutations in ATP6)
Human mtDNA
ATP6
ATP8
9
Syndrome NARP
Neuropathie
Ataxie
Rétinite
Pigmentaire
Maladie génétique rare transmise
maternellement Gène mitochondrial ATP6 ?
sous-unité a de lATP synthase ? essentielle
pour la synthèse dATP
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NARP syndrome
Mutation ponctuelle du gène mitochondrial
ATP6 Défaut synthèse en ATP Diminution
énergie cellulaire disponible Production accrue
en espèces réactives de loxygène (ROS) Mort
cellulaire
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Levure Modèle Saccharomyces cerevisiae Mutants
 NARP 
12
Modèle Saccharomyces cerevisiae
13
Modèle  NARP  chez la levure
Chez les patients NARP 5 Mutations ponctuelles
décrites (gène mt ATP6 ) T8993G ?
Leu156Arg T8993C ? Leu156Pro T9176G ?
Leu217Arg T9176C ? Leu217Pro T8851G ?
Trp109Arg
Construction des 5 mutations équivalentes chez S.
cerevisiae J.P. di Rago (IBGC, Bordeaux) ?
modèle  NARP  ? outil de criblage molécules
actives contre ce syndrome
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Croissance des mutants NARP de levure
milieu glucose
Sauvage
T8993G
T8993C
T9176G
T9176C
T8851C
Croissance normale sur glucose ATP ? Fermentation
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Criblage de molécules actives sur le modèle NARP
de levure
16
Principe du criblage
1 nuit à 30C
Tapis cellulaire du mutant NARP sur milieu
glycérolé ATP produit par la respiration
6
17
Principe du criblage
1 nuit à 30C
Tapis cellulaire du mutant NARP sur milieu
glycérolé ATP produit par la respiration
Sélection des molécules pour leur capacité à
restaurer la croissance respiratoire du mutant
NARP
6
18
Recherche dun contrôle positif
Validation du criblage
Acide dihydrolipoïque Molécule utilisée chez le
patient NARP Conservation activité entre lHomme
et la levure
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Criblage de chimiothèques exemples de
produits actifs
drogue C1 Repositionnement thérapeutique
Criblage environ 10 000 molécules ? 21 hits
positifs
20
Criblages secondaires Validation des hits
positifs sur dautres mutants
NARP
T8851C
T9176G
?fmc1
Sauvage
T8993G
T8993G
Mutants NARP (ATP6)
DMSO
T8851C
Drogue C1 / 2µM
Mutant assemblage ATP synthase
?fmc1
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Validation des hits positifs sur le modèle de la
drosophile
M. Palladino, Pittsburgh, Etats-Unis
Mutant spontané du gène mt ATP6 -
Neuropathie - Dégénérescence neuromusculaire -
Diminution de lespérance de vie
Celotto et al., J.Neurosci., 2006
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Conclusions

• - Isolement de molécules actives contre la
  mutation NARP T8993G (levure)
• ? 0,2 de hits positifs (21/10000)
• - Validation de lactivité de ces molécules sur
  dautres modèles
• ? sur dautres mutants de lATP synthase
  (levure)
• ? sur le modèle NARP de drosophile (M.
  Palladino, Pittburgh, EU)
• - Dépôt dune demande de brevet sur 5 molécules
  actives à la fois sur le modèle NARP chez la
  levure et la drosophile

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/ Perspectives
Projets en cours

• Tests de lactivité des hits positifs sur des
  modèles mammifères
• - Fibroblastes de patients (A. Munnich, A.
  Rötig)
• - Cybrides (lignées cellulaires issues de
  patients) (J.P. di Rago)
• - Etude des mécanismes daction des hits positifs
  (JP di Rago)
• Bioénergétique mitochondriale
• Vieillissement et stress oxydatif
• Morphologie mitochondriale

• Autres criblages (M. Blondel)
• sur le modèle NARP de levure
• Autres modèles de maladies mitochondriales chez
  la levure
• Test des hits positifs
• Criblage sur dautres modèles NARP preuve
  de principe
• - Développement des hits positifs (H. Galons)
• - Test molécules proches des hits positifs
• - Criblage inverse ? identification cible(s)
  biochimique(s)

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many thanks to
to ANR Maladies Rares AFM
Marc BLONDEL, Nathalie DESBAN, Cécile VOISSET,
Marie LE CANN, Eric GUEVELOU INSERM U613, Brest
Jean-Paul di RAGO, Malgorzata RAK, Roza
KUCHARCZYK IBGC, CNRS-UMR5095, Bordeaux
Stéphane BACH, Laurent MEIJER touteléquipe de
lUPS 2679 SBR, Roscoff
Agnès RÖTIG Arnold MUNNICH Hôpital Necker,
Paris
Alicia CELOTTO Michael PALLADINO University
School of Medicine, Pittsburgh
Fabienne GUG Hervé GALONS Pharmaceutical
Chemistry group, Paris
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(No Transcript)
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yeast NARP mutants have defect in ATP
production (JP di Rago)
Matrice
WT
L183R
L183P
L247R
L247P
W136R
L247
L183
R186
E59
W136
IMS
ATP6
ATP9
good correlation between severity of the mutation
and the decrease in ATP prod.
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proof of concept / why this approach should be
viable genetic suppressors of resp. defect of
NARP mutant (JP di RAGO)
frequency of appearance of suppressor of growth
defect on glycerol 10-5 to 10-6
isolation of both intragenic and extragenic
suppressors
therefore it should be possible to isolate drugs
able to suppress resp.defect!
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intragenic suppressors
29
in progress / perspectives
validation in animals ? primary cultures of
fibroblasts from NARP patients cybrids ?
testing drugs in animal models (drosophila)
to assemble a collection of respiration mutants
in yeast ? screening for compounds active
against other mitochondrial diseases ? testing
compounds active against NARP (specificity)
reverse screening using the most active compounds
to understand ? their mechanism of action ?
drugs side effects ? mechanisms of the
pathologies
link with aging ? yeast drosophila NARP
mutants also have a reduced lifespan ? the
compounds able to restore growth in yeast are
also able to partially suppress the
shortening of life expectancy in drosophila
30
yeast NARP mutants exhibit a reduced lifespan
31
active compounds partially suppress lifespan
defect linked to mutation in ATP6 in drosophila
(M. Palladino, University of Pittsburgh School of
Medicine)
from Celotto et al. J. of Neuroscience 2006