Diapositive%201

1
(No Transcript)
2

• Quelques éléments sur les spectromètres de masse

• Le séquençage des peptides

Manuel
TurboSequest
DeNovoX

• Quelques exemples dintégration de la
  spectrométrie de masse en biologie

3
Vue générale dun spectromètre de masse
Dynode Barette diodes
4
Méthode dionisation
Maldi (Matrix assisted Laser desorption
ionization)
Electrospray
5
Méthode dionisation (MALDI)
Matrice composé qui absorbe les UV (ex acide
sinapique)
6
Méthode dionisation (électrospray)
7
Analyseur de masse
Détermine le m/z des ions dérivés dun analyte
Lunité est le Thomson (Th) ou  m/z 
Attention masse ? m/z Exemple un peptide ionisé
de 1000 Da doublement chargé avec deux protons
sera observé comme un ion de m/z 501 (1000 2
divisé par 2)
Nombreux types
quadrupôle
Trappe à ions
Temps de vol (TOF)
8
Analyseur de masse (quadrupôle)
9
Analyseur de masse (trappe à ion)
10
Analyseur de masse (temps de vol)
11
Détecteur
Écran phosphorescent
Photomultiplicateur
12
MALDI-TOF
13
TRAPPE A ION
14
Exemple de spectre
15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
m Da
100
D(m/z) 1 Th ? ((m1) m)/1 1
D(m/z) 0,5 Th ? ((m1) m)/2 0,5
D(m/z) 0,33 Th ? ((m1) m)/3 0,33
D(m/z) 0,25 Th ? ((m1) m)/4 0,25
m1 Da
4
19
Spectrométrie de masse en biologie
20
Identification dune protéine à partir de
données de spectrométrie de masse Peptide Mass
Fingerprinting
Peptides obtenus par protéolyse
Spectre MS
Protéine
Démarche expérimentale
m/z
Comparaison
Séquence dune protéine
Spectre MS théorique
Peptides que lon obtiendrait avec la même
protéolyse
LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK
YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKML
IYTRNVCWCHGF PITREAESDD
Banque de données
etc
m/z
La protéine est identifiée par comparaison des
masses expérimentales avec une banque de peptides
générés  in silico  à partir des protéines
connues de la banque 
21
Fragmentation Dégradation post-source ou PSD
post source decay
2 Sélection dun peptide avant le tube de vol
3 Spectre MS pour vérifier la sélection du
peptide (ou ion) dit  parent 
2
2
3
1
4
m/z
m/z
1 Acquisition dun spectre MS
4 Ionisation/Désorption avec une énergie
laser plus élevée afin de provoquer un
excès dénergie interne des liaisons de la chaîne
peptidique qui vont rompre générant des ions
fragments et des fragments neutres
Les étapes dun PSD
2
5 Spectre PSD du peptide parent 2
m/z
22
Comment sélectionner le peptide parent?
Impulsion laser de plus haute énergie
Détecteur












Echantillon
Grille daccélération
Tube de vol zone libre de champ
Ion gate laissant passer les ions de m/z désirés
23
Exemple de spectre PSD
Peptide parent non fragmenté
Exemples de fragments


Intensité







m/z
24
Principe simplifié de la fragmentation


1


2


3


4
Fragment neutre non détecté
Fragment chargé détecté (parce que renvoyé par le
réflectron)
3
2
1
4
m/z
Spectre fragment dit  PSD 
25
A quoi sert le PSD? 1- A confirmer
lidentification
Spectre MS
Recherche dans les banques de données
1 protéine candidate identifiée par m1, m2 et m3
m3
m2
m1
m1
m3
YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKML
IYTRNVCWCHGFPITREAESDD
m/z
m2
Isolement de m3
m3
m3
TFGNHGGTK
m/z
Fragmentation in silico de m3
Fragmentation de m3
m3
m3
m/z
m/z
Comparaison des spectres
Spectre fragment théorique de m3
Spectre fragment de m3
CONCLUSION si le recouvrement des spectres est
bon il sagit bien de la même protéine
26
A quoi sert le PSD? 2- A lever une ambiguité
2 protéines candidates
Spectre MS
Recherche dans les banques de données
P1
P2
m3
m2
m4
m1
m4
m1
WCHGFPITREAESDD NPRTHSEIKNPMLKLLIHRFDSQASDRTWIILLH
GG
m3
YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKML
IYTRNVCWCHGFPITREAESDD
m/z
m3
m2
Isolement de m3
m3
m3
TFGNHGGTK
TWIILLHGG
m3
Fragmentation in silico de m3
Fragmentation in silico de m3
m/z
Fragmentation de m3
m3
m3
m3
m/z
m/z
Comparaison des spectres
Spectre fragment théorique de  m 3  de P1
Spectre fragment théorique de  m3  de P2
m/z
Spectre fragment de m3
Comparaison des spectres
CONCLUSION le spectre théorique qui présente un
bon recouvrement avec le spectre expérimental
correspond à la protéine recherchée
27
A quoi sert le PSD? 3- A identifier la protéine
Spectre MS
Recherche dans les banques de données
Banque
LIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCYILMNPRTHSEI
KNPMLKLWCHGFPITREAESDD
m3
m2
m1
Pas de protéine candidate
m/z
m3
TFGNHGGTK
Isolement de m3
Fragmentation in silico
m3
m/z
Fragmentation de m3
m/z
m3
Spectre fragment théorique
m/z
Interrogation des banques de données
Sélection de toutes les protéines possédant un
peptide de masse m3 qui, une fois fragmenté,
donne ces masses de fragment
Spectre fragment de m3
28
Spectrométrie de masse en tandem
Les spectromètres de masse en tandem

• Tandem dans lespace
• Tandem quadrupôle
• Quadrupôle-TOF
• Reflectron-TOF

• Tandem dans le temps
• Trappe à ion
• FITCR

29
Dissociation induite par collision des ions
peptidiques formés par électrospray
ATSFYL
30
Dissociation induite par collision des ions
peptidiques formés par électrospray
ATSFYK
Migration du proton mobile
31
Les séries des ions peptidiques
Le proton mobile ? la collision génère
essentiellement des séries b et y
32
Les masses des résidus dacide amminé et des ions
immoniums
33
La formation des ions immoniums
34
Les ions immoniums

• Les ions immoniums sont trouvés dans la zone de
  faible masse des spectres MS/MS (m/z lt 200).
• Ils révèlent partiellement la composition en
  acides aminés du peptide.
• Ils résultent dau moins deux clivages de
  liaisons internes du peptide.

35
(No Transcript)
36
Les masses des autres résidus diffèrent toutes
dau moins 1 Da
Les masses des résidus sont calculées sur des
différences
37
Analyse des spectres
38
La série des ions y et b
Lorsquun ion dune série est reconnu, son m/z
est utilisé pour calculer le m/z de lion
correspondant de lautre série. Ce dernier est
ensuite repéré sur le spectre. (attention aux
erreurs darrondissement)
39
La recette pour analyser les spectres MS-MS
1- Inspecter la région des faibles masses pour
identifier les ions immoniums
2- Inspecter la région des faibles masses pour
identifier l ion b2 Lion b2 est généralement
reconnaissable par une différence de 28Da avec
lion a2 Le m/z de lion b2 est ensuite utilisé
pour calculer le m/z de lion yn-2
correspondant Lion yn-2 est ensuite repéré sur
le spectre dans la région des hautes masses
3- Inspecter la région des faibles masses pour
identifier lion y1 Ceci consiste à identifier
lextrémité C-term. On recherche dans les faibles
masses soit un m/z 147 (lysine en Cterm) soit
un m/z 175 (arginine en Cterm) Le m/z de lion
y1 est ensuite utilisé pour calculer le m/z de
lion bn-1 correspondant Lion bn-1 est ensuite
repéré sur le spectre dans la région des hautes
masses sil est présent
4- Inspecter la région des hautes masses pour
identifier lion yn-1 Ceci consiste à identifier
lextrémité N-term des combinaisons indiquées par
lion b2 La région des hautes masses est étudiée
pour identifier lion yn-1 sil est présent. La
liste des combinaisons de 2 aa obtenus par lion
b2 limite les masses des résidus à considérer. Si
un ion est identifié, les 2 premiers aa sont
identifiés.
5- Etendre la série des ions y à partir des
faibles m/z
6- Etendre la série des ions b à partir des
hautes m/z
7- Calculer la masse du peptide contrôler si
cest en accord avec le spectre
8- Contrôler la composition en aa et les
résultats du spectre Regarder si le contenu en aa
est en accord avec les ions immoniums présents
sur le spectre Regarder létat de charge en
considérant la présence dhis ou la présence
interne de Lys et dArg.
9- Essayer didentifier tous les ions du
spectre Rechercher les perte dH2O, NH3, HSOCH3.
Identifier tous les ions doublement chargés et
ceux issus de clivage interne
40
Exemple danalyse des spectres MS-MS
778.6 monochargé
41
Exemple danalyse des spectres MS-MS
Yn-1
128.9
Soit y n-1 665.2 et aa Nterm 113.4
(778.6-665.2) cest à dire X
42
Exemple danalyse des spectres MS-MS
518.3
261.2
100
233.0
665.2
303.1
120.2
500.2
Abondance relative ()
50
137.4
380.9
647.2
b1
b2
bn-1
575.0
431.2
87.1
147.1
557.2
261.2
632.3
114.1
476.0
348.0
458.0
204.1
632.3
0
K
F
X
371 Da
m/z
yn-3
Y1
b2
Yn-2
bn-3
bn-1
Yn-1
518.3
147.1
665.4
Yn-2
y1
Yn-1
Histidine mais il y aurait un triplement chargé
Sérine
Si cétait lHistidine yn-3 380.9 et bn-3
397.7 qui nexiste pas sur le spectre
43
Exemple danalyse des spectres MS-MS
518.3
261.2
100
233.0
665.2
Q ou K mais si K il y aurait du triplement chargé
donc Q Ainsi yn-4 303.1 et en conséquence b4
475.5 or il existe un 476
303.1
120.2
500.2
Abondance relative ()
50
380.9
647.2
575.0
431.2
147.1
557.2
476.0
348.0
204.1
458.0
632.3
0
m/z
b2
Y1
Yn-2
Yn-3
b3
bn-1
Yn-1
b4
44
Exemple danalyse des spectres MS-MS
518.3
261.2
100
233.0
665.2
70.1 qui pourrait être difficilement une Ala et
de plus il ny a rien en 545 pour compléter la
série b
303.1
120.2
500.2
Abondance relative ()
50
380.9
Perte de 18 H2O
647.2
575.0
431.2
147.1
557.2
476.0
348.0
204.1
458.0
632.3
0
m/z
b2
Y1
Yn-2
Yn-3
b3
bn-1
Yn-1
Yn-4
Yn-5
b5
b4
99 qui pourrait être une valine et en conséquence
il faudrait un ion en série b de 574.5 or on
observe un ion de 575
45
Exemple danalyse des spectres MS-MS
518.3
261.2
100
233.0
665.2
303.1
120.2
500.2
Abondance relative ()
50
380.9
Perte de 18 H2O
647.2
575.0
431.2
147.1
557.2
476.0
348.0
204.1
458.0
632.3
0
m/z
b2
Y1
Yn-2
Yn-3
b3
bn-1
Yn-1
Yn-4
Yn-5
b5
b4
57 qui pourrait être une glycine et en
conséquence il faudrait un ion en série b de
631.5 or on sait déjà quil y a bn-1 632.3
46
Exemple danalyse des spectres MS-MS
261.2
100
233.0
665.2
303.1
120.2
500.2
Abondance relative ()
50
380.9
Perte de 18 H2O
647.2
575.0
431.2
147.1
557.2
476.0
348.0
458.0
204.1
632.3
0
m/z
Y1
b2
Y4
Y5
b3
b6
Y6
Y3
Y2
b4
b5
X F S Q V G K
47
TurboSequest
48
TurboSequest
1- digestion in silico des protéines de la banque
2- calcul des m/z des ions y et b. Une intensité
de 50 est arbitrairement attribué à ces m/z
3- les pertes dammonium, deau et les ions a
sont ajoutés au spectre avec une intensité
arbitraire de 10
4- De part et dautre de chaque ion y et b sont
ajoutés au spectre des ions ( 1 m/z) avec une
intensité arbitraire de 25
5- De part et dautre de chaque ion issue dune
perte de neutre et des ions a sont ajoutés au
spectre des ions ( 1 m/z) avec une intensité
arbitraire de 10
1- Le spectre est divisé en 10 sous sections de
taille équivalente
2- Dans chaque sous section les ions sont
normalisés en affectant une intensité arbitraire
de 50 à lion le plus intense
49
L F S Q V G K
Création des spectres MS2 théoriques
Autres pertes ?
m/z
50
Modification des spectres MS2 expérimentaux
100
50
51
Modification des spectres MS2 expérimentaux
100
50
0
52
Comparaison
53
TurboSequest
Les numéros et le nombre de spectres pour chaque
peptide
54
TurboSequest
Masse du peptide calculée à partir du résultat
expérimental
55
TurboSequest
Etat de charge du peptide déterminée à partir du
résultat expérimental
56
TurboSequest
Séquence du peptide de la banque de données
correspondant le mieux au résultat expérimental
57
TurboSequest
Référence du gène qui code pour la protéine ou
référence de la protéine qui contient le peptide
58
TurboSequest
Nom de la banque de données
59
TurboSequest
Valeur indiquant la corrélation entre les
spectres calculés et mesurés. Ce coefficient est
significatif si gt2
60
TurboSequest
Différence entre les valeurs normalisées (0 à 1)
du Xcorr. Ce coefficient traduit la similarité
entre les meilleurs scores. Il doit être gt 0.1
61
TurboSequest

• Sp (? im) ni (1?)(1?)/nt
• im Intensité des ions qui  matchent 
• ni Nombre dions qui  matchent 
• ? paramètre de 0.075 ajouté si une série
• continue dions est observée (sinon 0)
• ? paramètre de 0.15 ajouté si un immonium
• (His, Tyr, Trp, Met et Phe) est trouvé
• nt nombre total dion prédit

Sp est le premier score calculé lors de la
comparaison entre le spectre mesuré et les
spectres théoriques. Sp gt 500 (20 aa) ou Sp gt200
(6 aa)
62
TurboSequest
Classement des peptides candidats après le calcul
préliminaire. Ce paramètre doit être lt 10
63
TurboSequest
Il est rarissime dobserver une couverture de 100
, 70 à 80 est correct
Nombre dion qui  matchent  sur le nombre
théorique dion que peut produire le peptide
64
TurboSequest
Nombre de peptides qui ont permis de trouver la
protéine en 1ère position, en 2ème position, en
3ème position etc.
65
DeNovoX
66
DeNovoX
67
DeNovoX
68
(No Transcript)
69
Séquençage dEdman
Cyclic degradation of peptides based on the
reaction of phenylisothiocyanate with the free
amino group of the N-terminal residue such that
amino acids are removed one at a time and
identified as their phenylthiohydantoin
derivatives
70
Les approches globales en protéomique MudPit
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Poubelle
Lavage
71
Les approches globales en protéomique MudPit
Remplissage de la boucle dinjection du famos
(1µl)
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Echantillon
Poubelle
Lavage
72
Les approches globales en protéomique MudPit
Charge de la colonne échangeuse dions
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Les ions non retenus sur la colonne échangeuse
dions sont concentrés et dessalés sur la colonne
de préconcentration
Poubelle
Lavage
73
Les approches globales en protéomique MudPit
Séparation sur la nanocolonne de phase réverse
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Les ions concentrés et dessalés sur la colonne de
préconcentration sont séparés sur la nanocolonne
en phase réverse
Poubelle
Lavage
74
Les approches globales en protéomique MudPit
Remplissage de la boucle dinjection du famos
(1µl)
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
20 mM acétate dammonium
Poubelle
Lavage
75
Les approches globales en protéomique MudPit
Charge de la colonne échangeuse dions
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Les ions retenus sur la colonne échangeuse dions
sont élués avec 20 mM dacétate dammonium,
concentrés et dessalés sur la colonne de
préconcentration
Poubelle
Lavage
76
Les approches globales en protéomique MudPit
Séparation sur la nanocolonne de phase réverse
Gradient 200 nl/min
BioX-SCX 500 µm id 15 mm
RP Trap column C18 300 µm id 5 mm
Nano C18PM 75 µm id 15 mm
Pompe 30 µl/min
Poubelle
Poubelle
Les ions concentrés et dessalés sur la colonne de
préconcentration sont séparés sur la nanocolonne
en phase réverse
Poubelle
Lavage
77
Les approches globales en protéomique MudPit
Les mêmes étapes sont répétées avec 50mM, 100 mM,
200mM, 400mM, 600mM, 800mM, 1000mM et 2000mM
Acétate dammonium
78
Les approches globales en protéomique MudPit
79
Les approches globales en protéomique MudPit
Extrait total levure 20 mM acétate dammonium
80
Les approches globales en protéomique MudPit