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• Esercitazioni di Biochimica Applicata
• Introduzione alle metodologie di base per
  lanalisi delle proteine
• 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in
  un campione biologico
• Proteine cellulari - tecniche di omogeneizzazione
  e centrifugazione arricchimento della/le
  proteina/e studiate in frazioni sub-cellulari
  ottenute da omogenato dorgano, tessuto, linee
  cellulari
• Saggio analitico nella frazione subcellulare
  (saggio enzimatico)
• Cinetica enzimatica
• Procedure di separazione delle proteine in studio
  (elettroforesi su gel)
• Analisi di proteine specifiche o totali nei
  diversi tessuti e distretti anatomici, in liquidi
  biologici e colture cellulari tecniche
  separative più risolutive, metodi di
  identificazione e purificazione.
• In particolare Western blot, elettroforesi
  bidimensionale, proteomica, tecniche
  cromatografiche, purificazione allomogeneità,
  sequenziamento.

Tecniche mirate
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Il dosaggio quantitativo delle proteine viene
applicato

• per conoscere quante proteine sono presenti in un
  determinato preparato biologico, prima di
  procedere verso ulteriori analisi relative ad una
  o più proteine esempi
• per calcolare lattività specifica durante i
  saggi funzionali (es. per vel. enzimatica)
• per calcolare la densità specifica di un
  recettore nei saggi di legame (binding) dei
  recettori proteici
• come indice di purezza/resa della proteina
  studiata durante le fasi progressive di
  purificazione
• prima di una separazione cromatografica o
  elettroforetica (SDS-PAGE, Western blot,
  proteomica).

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Dosaggio della concentrazione di proteine
totali in un campione biologico Metodi
chimici Metodo Kjeldahl (N totale) Metodi
spettrofotometrici -metodo in assorbanza UV a
280 nm (amminoacidi aromatici) - Metodi
colorimetrici Metodo del biureto Metodo di
Lowry Metodo BCA (acido bicinconinico) Metodo
di Bradford Metodi turbidimetrici
precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi
turbidimetrica del precipitato.
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Metodo di Kjeldahl Determinazione dellN
proteico trasformato in gr proteine mediante un
fattore di conversione- Per incrementarne
laccuratezza precipitazione delle proteine con
TCA, TFA o PCA, lavaggio per centrifugazione e
precipitato usato per lanalisi successiva 1)
Digestione il campione con le proteine viene
portato ad alta temperatura in presenza di
H2SO4 concentrato catalizzatore (ex. Cu2SO4)
ossidanti (ex. permanganato o H2O2) tutto lN
organico si trasforma in NH4, ossidazione di C e
S a CO2 e SO2 2) Distillazione (NH4)2SO4
formato 2NaOH 2NH3 (raccolta x distillazione)
Na2SO4 2 H2O 3) Titolazione NH3 raccolta
e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl)
a titolo noto.
Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in
un campione 1 mol HCl 1 mol NH3 14 gr
N Quantità di N nel campione in gr ml HCl x M
HCl x 14/1000 Quantità di proteine nel campione
in gr ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16 se si
considera che il contenuto medio di N proteico è
16.
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Metodi spettrofotometrici - colorimetrici
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I 20 L-amminoacidi che formano le proteine
Legame peptidico
Dosaggio proteine
Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che
possono coinvolgere il legame peptidico o i
gruppi R di alcuni AA
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Metodi spettrofotometrici
PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI
DOSAGGIO DELLE PROTEINE
Sensibilità quantità più piccola di proteine
determinabile nel campione biologico
Specificità capacità di quantificare solo le
proteine del campione Interferenze queste
possono alterare sia accuratezza che specificità
del metodo es. assorbimento alla l analitica di
componenti del campione diverse dalle proteine
(es. acidi nucleici) interferenze del mezzo, ex.
sali del tampone, con la formazione di complessi
colorati (metodi colorimetrici) Capacità
relativa o assoluta di misurare le proteine del
campione biologico dipendenza dalla composizione
in certi aminoacidi delle proteine o meno metodo
relativo, metodo assoluto importante durante
procedura di purificazione. Integrità del
campione capacità o meno di lasciare integro il
campione con possibilità di utilizzarlo in altri
dosaggi Stabilità metodi colorimetrici,
stabilità nel tempo dei complessi colorati.
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ASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINE
Caratteristiche Sensibile 10-20
mg Integrità del campione si Stabilità
si Interferenza con basi azotate acidi
nucleici (si corregge a 260 e 280 nm) Metodo
relativo può variare in base al tipo di proteine
presenti.
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Metodi colorimetrici
Metodo capostipite di altre tecniche
colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del
BCA.

• Caratteristiche
• Integrità campione no
• Metodo ritenuto
• assoluto, più costante
• di UV .

• Scarsa sensibilità

Reattivo di Benedict solfato di rame CuSO4 in
soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di
K o Na
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Metodo di Folin classico Residui fenolici
quali gruppi R di AA aromatici (specialmente
tirosina) , sono ossidati da reattivo di
Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino acidi
fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono
a composti di colore blu. Il Lowry incrementa
sensibilità associando biureto e Folin.
Caratteristiche
Integrità campione no Stabilità e tempistica
stabile entro limiti di tempo, lettura dopo 30
min. Procedura relativamente lunga. Metodo
ritenuto più costante specifico e sensibile
rispetto a UV, Folin classico e biureto.
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Integrità campione no Stabilità
buona. Tempistica procedura lunga. Interferenze
lipidi, detergenti, EGTA DTT (ditiotreitolo
gt1mM). Migliore del Lowry per detergenti, sali
etc..
rid
Quota di ioni rameici ioni rameosi
dalle proteine in ambiente alcalino. Lacido BCA
chela ioni rameosi formando un complesso colorato
molto stabile.
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Residui di arginina, triptofano, tirosina e
fenilalanina
Integrità campione no Stabilità più stabile
degli altri metodi rapidità di esecu- zione
non richiede incubazione dopo aggiunta reagente.
Metodo relativo- Sensibilità comparabile a
Lowry
Interferenze con detergenti
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Metodo del Biureto retta di calibrazione due l
analitiche, a sensibilità diversa 545 nm,
quantità di proteine misurabile 1 5 mg 330 nm,
quantità di proteine misurabile 0.1-1 mg
Retta a 330 nm
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Metodo del Bradford retta di calibrazione l
analitica 595 nm