SISTEM

1
SISTEM KULTUR JARINGAN
Berdasarkan macam media tanam, sistem kultur
jaringan dibedakan mjd

• Metode Padat (Solid Method)
• ? dilakukan dgn tujuan mendapatkan kalus dan
  kmd dgn medium diferensiasi yg bguna utk
  menumbuhkan akar dan tunas shg kalus dapat
  membentuk planlet.
• Media Padat
• ? media yang mengandung semua komponen kimia
  yang dibutuhkan tanaman dan kmd dipadatkan dgn
  menambahkan zat pemadat (misalnya agar-agar)

2

• Media yang terlalu padat ? mengakibatkan akar
  sukar tumbuh, sebab akar sulit menembus ke dalam
  media
• Media yang terlalu lembek ? menyebabkan kegagalan
  dlm pekerjaan (misal karena eksplan tenggelam
  dalam media ? eksplan tdk dapat tumbuh menjadi
  kalus karena tempat area kalus pada irisan
  (jaringan yg luka) tertutup media

• Metode padat dapat digunakan untuk
• Kloning
• Menumbuhkan protoplas setelah diisolasi
• Menumbuhkan planlet dari protokormus stlh
  dipindahkan dari suspensi sel
• Menumbuhkan planlet dari protoplas yg sudah
  didifusikan (digabungkan)

3
b. Metode Cair (Liquid Method) ? dianggap
kurang praktis karena untuk menumbuhkan
kalus lgsg dr eksplan sangat sulit shg
keberhasilannya sangat kecil. Penggunaan media
cair lebih ditekankan untuk suspensi sel ? yaitu
menumbuhkan plb (protocorm like bodies). Plb
dapat tumbuh menjadi planlet jika dipindahkan ke
dalam media padat yang sesuai. Media Cair ?
pembuatan lebih cepat tdk memerlukan zat
pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan
nutrien
Suspensi sel ? mrpkan hasil kultur kalus, dmana
kalus didefinisikan utk kumpulan sel yg blm
berdiferensiasi, jika dipisahkan dlam kultur cair
disebut kultur suspensi
4
c. Metode Semi Padat (Semi Solid) ? biasanya
untuk mikropropagasi ? menumbuhkan bagian
tanman dalam media aseptis dan kemudian bagian
tanaman tersebut diperbanyak sehingga dihasilkan
tanaman sempurna dalam jumlah banyak
Media semi padat ? digunakan dgn beberapa
alasan- eksplan yg kecil mudah terlihat dalam
media padat - eksplan berada di permukaan
media sehingga tdk memerlukan teknik
aerasi tambahan pada kultur - Orientasi
pertumbuhan tunas dan akar tetap - kalus
tidak pecah jika ditempatkan di media cair
5
KULTUR KALUS DAN SUSPENSI SEL
6

• Kalus
• Suatu jaringan yg tersusun oleh sel-sel
  terdediferensiasi yg umumnya dihasilkan oleh
  jaringan yg luka atau kultur jaringan pada media
  yang berisi auxin ttt
• Pertumbuhan aktif massa sel yg belum
  terdiferensiasi dan tidak terorganisir yg
  berkembang dari jaringan luka atau kultur
  jaringan yg ditanam pada media dengan tambahan
  zat pengatur tumbuh

Kultur kalus ? teknik budidaya kalus tanaman dlm
suatu lingkungan terkendali dan dalam keadaan
aseptis atau bebas mikroorganisme
7
Tujuan

• Memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan
  ditumbuh dlm lingkungan terkendali ? diharapkan
  mampu memperbanyak diri secara terus-menerus
• Menjamin kesinambungan kerja kultur
• Meningkatkan jumlah kalus ? untuk produksi/
  perbanyakan
• Sarana bank plasma nutfah yang efisien
• Dapat digunakan utk tujuan produksi metabolit
  sekunder

8
Tekstur kalus

1. Keras dan kompak ? kalus mengalami pembentukan
   lignifikasi
2. Remah (friable) ? kalus yang tumbuh
   terpisah-pisah mjd fragmen-fragmen yg kecil

Remah
Kompak
9
Warna kalus
Warna kalus dapat bermacam-macam ? warna
kekuning-kuningan, putih, hijau, kuning
kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin
ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
10
(No Transcript)
11
Berdasarkan kebutuhan ZPT untuk membentuk kalus,
jaringan tanaman digolongkan dlm 4 grup

• Jaringan tan. yg membutuhkan hanya auksin selain
  gula garam mineral utk dpt membentuk kalus.
  Cth umbi artichoke
• Jaringan yg memerlukan auksin sitokinin selain
  gula dan garam mineral spt empulur tembakau.
• Jaringan yg tidak perlu auksin dan sitokinin,
  hanya gula dan garam mineral spt jaringan
  kambium.
• Jaringan yg membutuhkan hanya sitokinin, gula,
  dan garam-garam mineral seperti parenkhima xylem
  dari akar turnip.

12

• Pada umumnya, kemampuan pembentukan kalus dari
  jaringan tergantung juga dari
• Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
• Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
• Bagian tanaman yang dipakai
• Jenis tanaman.

Inisiasi pembelahan sel yang hanya terbatas di
lapisan luar dari jaringan, menurut Yeoman (1970)
kemungkinan disebabkan oleh faktor-faktor 1.
Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi 2.
Keluarnya gas CO2 3. Kesediaan hara yang lebih
banyak 4. Penghambat yg bersifat folatik lebih
cepat menguap 5. Cahaya
13

• Sel-sel yg heterogen selain berasal dari materi
  asalnya, dpt jg tjd akibat masa kultur yg
  panjang melalui subkultur berkali-kali.
  Perubahan yg terjadi, dapat merupakan
• Aberasi khromosom
• Mutasi gen
• Endoreduplikasi yang menghasilkan poliploidi
• Transposisi urutan DNA (DNA sequences
  transposition)
• Amplifikasi gen Jumlah gen untuk suatu sifat
  ttt per genome haploid bertambah
• Hilangnya suatu gen (deletion).

14

• Contoh prosedur dlm inisiasi kultur kalus, dapat
  diperoleh dgn menumbuhkan potongan wortel dekat
  lingkaran kambium, di dalam media MS. Tahapannya
  adalah sbb
• I. Persiapan eksplan
• Wortel yang segar dan sehat, buang bagian yg
  kotor
• Cuci wortel dengan detergent, kupas kulit
  luarnya, lalu iris dalam potongan kira-kira 2
  cm.
• Sterilkan dalam alkohol 70 selama 1 menit.
• Bilas dengan aquadest steril
• Rendam dalam larutan clorox 20, selama 10 menit.
• Bilas lagi 3 kali dalam aquadest steril
• Bagian ujung-ujung eksplan yang kontak dgn
  larutan sterilisasi, dipotong.
• Ambil bagian kambium dan tanam di dalam media MS
  dengan hormon 2,4-D

15

• II. Media dan lingkungan kultur
• Media MS diberi tambahan ZPT
• Tiga eksplan ditanam dalam satu botol media.
  Ketiga eksplan ini dianggap sbg satu unit
  percobaan.
• Kultur diberi label yang berisi keterangan
• Jenis tanaman
• Bagian yang diambil
• Kode media
• Tanggal tanam
• 4. Kultur diletakkan pada rak terbuka di dalam
  ruang kultur dengan temperatur rata-rata 25?C
  dalam diffuse light.

16

1. Periksa kultur setelah satu minggu, untuk melihat
   perkembangan kultur
2. Setelah 4 minggu, kalus yang friable dapat
   disubkultur pada media baru.
3. Untuk melihat sel, dapat dipergunakan mikroskop
   cahaya dengan pembesaran 1.000 kali, setelah sel
   itu diberi larutan toluidine blue (0.05 w/v).

III. Pengamatan pertumbuhan kalus Parameter
pertumbuhan yg digunakan utk menilai pengaruh
media, eksplan, faktor-faktor lain, adl
1. Berat basah kalus 2. Berat kering
kalus 3. Diameter kalus
17
KULTUR SUSPENSI SEL

• Mrpkan suatu sistem yg sesuai utk mempelajari
  metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan
  pada sel, serta diferensiasi sel.

• Dapat dimanfaatkan utk memproduksi suatu zat
  langsung dari sel tanpa membentuk tanaman lengkap
  baru
• Sel yang digunakan dpt direkayasa secara genetik
  untuk meningkatkan sintesa zat tertentu

18
Dalam segi praktisnya, kultur suspensi sel
digunakan sebagai sumber
a. Sel-sel untuk protoplasma b. Sel-sel yang akan
diberi perlakuan mutagen kimia c. Sel utk studi
hubungan host-patogen dalam fitopatologi d. Massa
utk produksi bahan-bahan sekunder e. Sel-sel
untuk media seleksi
19

• Kultur suspensi dikocok supaya
• Pemecahan gumpalan sel menjadi agregat kecil dan
  sel tunggal
• Distribusi sel yang merata dalam media
• Pertukaran gas antara media dan udara

• Selama masa inkubasi, terjadi pertambahan biomass
  yang mengikuti pola sigmoid. Setelah mencapai
  suatu masa tertentu, sel berhenti membelah karena
  
• Kehabisan hara
• Akumulasi metabolik yang toxic

19
20

• Kultur suspensi sel dapat diinisiasi dari kalus
• Prosedur
• Tumbuhan kalus wortel seperti yang dijelaskan
  dalam sub-sub kultur kalus.
• Siapkan media cair MS yang diberi 2,4-D 1.0 mg/1
  dalam labu erlenmeyer. Tiap erlenmeyer berisi 25
  ml media. Suspensi sel wortel tidak memerlukan
  sitokinin.
• Siapkan beberapa petridish steril dan sendok
  stainlees steel steril.
• Timbangan analitik kecil dibersihkan dengan
  alkohol 70 dan dimasukkan ke dalam laminar air
  flow cabinet.

21

1. Ambil kalus dari beberapa botol kultur padat
   secara hati-hati dgn sendok steril dan kumpulkan
   dalam petridish steril, kemudian petridish
   ditutup.
2. Timbang petridish steril lain. Catat berat kosong
   petridish tersebut.
3. Timbang kalus dalam petridish steril yang sudah
   ditimbang sebanyak 200-250 mg, tergantung dari
   ketersediaan barang.
4. Masukkan kalus secara berhati-hati ke dalam media
   cair.
5. Sebelum ditutup kembali, mulut botol Erlenmeyer
   dipanasi terlebih dahulu.

22

• Beri label yang berisi keterangan jenis tanaman,
  media dan tanggal tanam.
• Letakkan kultur pada shaker dgn kecepatan 100
  rpm.
• Temperatur ruangan 25-27 derajat celcius.
• Bila kultur mjd keruh seperti susu,h al ini
  menanda kontaminasi bakteri. Bila cairan mjd
  merah muda, sering kali kontaminasi adalah ragi.
  
• Kontaminasi kadang2 disebabkan juga oleh cendawan
  yg ditandai lapisan spt kerak pada permukaan
  media, atau gumpalan kecil yang berwarna putih
  hitam. Kultur harus segera dibuang.
• Subkultur dapat dilakukan 7-10 hari kemudian