Diapositiva 1

1
Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia
2
Metilazione del DNA e Repressione della
Trascrizione
Trascrizione attiva
Repressione
TF
X
POLII
TF
X
CH3
CH3
CH3
C
C
C
C
C
C
MeCP
DNA-non metilato
DNA metilato
3
Metilazione nel genoma umano

• Le CpG islands 200 bp-5000 bp. Si trovano
  principalmente nei promotori dei geni e negli
  introni.
• Sono normalmente non-metilate nei geni
  house-keeping
• Sono metilate nei geni tessuto-specifici. La
  demetilazione determina il differenziamento
  cellulare (es geni del differenziamento
  mieloide, HbF)

Herman et al, NEJM, 2003
4
Silenziamento trascrizionale epigenetico
DNMT1, 3a, 3b
Ipermetilazione
Istone metilasi
DNMT
HDAC
MBP
Silenziamento genico
5
L ipermetilazione globale e frequente nelle LMA
Costello et al, Nature Genetics, 2000
6
Ipermetilazione di geni oncosoppressori
Lipermetilazione contribuisce alla
trasformazione e alla progressione neoplastica
mediante linattivazione di geni oncosoppressori
L ipermetilazione di diversi geni si trova gia
nelle lesioni pre-cancerose del colon, indicando
il possibile ruolo dellipermetilazione durante
la iniziazione della tumorigenesi. Elevata
frequenza di ipermetilazione anche nelle MDS.
Analogamente al colon, le MDS rappresentano
spesso la fase pre-neoplastica delle AML

• Il 68 delle t-MDS/t-AML presenta ipermetilazione
  di p15, che correla con la presenza di 7q-, allo
  stadio della t-MDS, e alla percentuale di blasti
  midollari (Christiansen, Leukemia 2003).

7
The Hallmarks of Cancer
Crescita autonoma
Ridotta sensibilita ai segnali inibitori della
proliferazione
Blocco dell Apoptosi
U
Cancro
M
?
Angiogenesi
Angioinvasivita e Metastasi
Replicazione Incontrollata
8
Geni ipermetilati in Ematologia
Funzione Gene Mieloide Linfoide
Ciclo cellulare p15, p16 (Inib-Kinasi-CD) MDS, AML, CML ALL, NHL, MM
Trasduzione segnale RARb AML ALL, NHL, MM
Trasduzione segnale Estrogen receptor AML, CML ALL, NHL, MM
Apoptosi P73 (p53-like) transcr.factor ALL, NHL, MM
Apoptosi DAP-kinasi AML-MDS ALL, NHL, MM
Contatto cell. Metastasi E-Caderina (Ca/adesione cell.) CML (Cadherin-13), AML ALL, NHL (Cadherin-13), MM
9
Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA
Diretto Iperespressione di DNMT1, 3a, 3b
Mizuno et al, Blood 2001
10
Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Indiretti

• AML1/Eto lega HDAC e reprime la trascrizione
• (Amman et al, MCB 2001)

Nella APL PML/RARa lega DNMT3a e interferisce
con HDAC,bloccando lespressione di geni
RAR-dependent (Di Croce et al, Science 2002)
11
Geni importanti per la leucemogenesi, regolati
dalla metilazione del promotore
MGMT(O6-metilguanina-metiltransferasi) è un gene
di riparazione del DNA che rimuove agenti
alchilanti e citotossici dalla posizione 06
della guanina.
DAP-chinasi è una serin/treonina chinasi,
regolata da calcio e calmodulina, con una
funzione pro-apoptotica.
GSTP1 e un gene di detossificazione.
BRCA-1 e un gene di riparazione/ricombinazione
del DNA, importante nel mantenimento
dellintegrita genomica. E metilato nel 65 dei
tumori ovarici e nel 10 di quelli mammari
non-ereditari.
12
Methylation-Specific PCR (MSP)
100 bp DNA Ladder
Unmethylated
Methylated
13
Frequenza di ipermetilazione nelle LMA (n150)
Unmethylated
Methylated
14
Ipermetilazione
e leucemie
therapy
-
related
13/17
Therapy
-
related
Therapy
-
related
80
80
De novo
De novo
60
60
15/30
50/100
40
40
7/25
40/154
18/111
4/25
20
20
4/111
0
0
DAP
-
K
MGMT
BRCA
-
1
GSTP
-
1
p 0.01
P 0.04
p 0.06
p 0.2
OR 2.8 (1.3-6.3)
OR 5 (1.2-22)
15
Ipermetilazione e Prognosi
T-MDS
Overall Survival
Christiansen et al, Leukemia 2003
16
Leucemia linfoblastica acuta
Roman-Gomez-J, n251 pts, Blood 2004
17
ALL
DFS
OS
Roman-Gomez-J, n251 pts, Blood 2004
18
MGMT e Prognosi 84 pts con B-DLCL
Esteller et al, JNCI 2001
19
Agenti demetilanti
Demetilanti Azacitidina, Decitabina, Pseudoisocit
idina, 5-Fluorodeoxicitidina,Zebularina,
Procainamide (?)
Inibitori dell Istone Deacetilasi Acido
Valproico, sodio-fenil-butirato, Tricostatina,Deps
ipeptide
TF
CH3
CH3
CH3
C
C
C
Trascrizione attiva
20
Meccanismo di azione dellAzacitidina
Herman et al, NEJM, 2003
21
Treatment of Jurkat cell line
Decitabina
Azacitidina
10
Ac.Ac
Ac.Ac
Tc
Tc
Cells (106/ml)
Aza 0,5µM
Aza 1µM
Days of culture
22
5 aza-2-deoxicytidine Treatment Raji cell
line Demethylation MSP DAP-Kinasi
200 nM DAC
1 µM DAC
mock
0
J
-
days
Unmethylated reaction
Methylated reaction
23
5 aza-2deoxicytidine Treatment Raji cell
line Expression
200 nM DAC
mock
1 µM DAC
days
DAP-KINASE
M
GAPDH
24
Demethylation of DAP-KINASE and Apoptosis (HL-60
cells)

Day 4
2.3
14
Aza
Ac.Ac
25
5-azacytidine Treatment N 191 pz with MDS 75
mg/m2 per 7 gg, ogni 28 gg
At 4 months Aza 60 response CR 7 PR
16 Improved 37 Supp. Care 5 improved
N37 pz no CR/PR
Silverman et al, JCO 2002
26
Time to AML transformation or Death
N191 MDS pz
OS in relazione allIPSS
Leucopenia grado 3-4 59 Neutropenia
81 Trombocitopenia 70 Infezioni 20 Nausea e
vomito 4
Median Time to Progression Aza 21 mesi Supp.
Care 12 mesi
Silverman et al, JCO 2002
27
Decitabine Treatment N162 pz IPSSgtIntermedio 1
PLTs stabili
PLTs
Van den Bosch et al, Leukemia 2004
28
Decitabine Escalating doses N48, 35 AML, 7
MDS, 5 CML, 1 ALL
Non-hematological side-effects
Issa et al, Blood 2004
29
Decitabine Bu/Cy for BMT (N 43 pz)
Overall Survival
Decitabine 400 mg/m2 600 800 Days -10 e -11
De Lima et al, Cancer 2003
30
Rischi della demetilazione Attivazione di
proto-oncogeni Instabilita cromosomica Mutazioni

• Topi con ridotta DNMT1 presentano
  ipometilazione diffusa con ridotta stabilita
  genomica e presentano unelevata incidenza di
  linfomi T (Gaudet et al, Science 2003)

• La sindrome ICF (immunodeficit, instabilita dei
  centromeri e anomalie faciali) e dovuta a una
  mutazione della DNMT3B e si caratterizza per una
  diffusa ipometilazione del DNA satellite.
  Incidenza di tumori non aumentata.

• La demetilazione farmacologica e transiente e
  reversibile entro 2 settimane (Yang AS, Science
  2003)