Diapositiva 1

1
Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea
Magistrale in Neurobiologia Docente Prof. Mauro
Toselli mtoselli_at_unipv.it
Potrete scaricare gli argomenti trattati a
lezione al seguente indirizzo web www.unipv.it/ts
lmra22
Foundations of cellular neurophysiology D.
Johnston S. M-S. Wu The MIT Press
Durante il corso una esercitazione
obbligatoria Occorre fornire il proprio indirizzo
di posta elettronica
2
Di cosa si occupa la Biofisica
In questo corso ci occuperemo di biofisica della
cellula con particolare riguardo alle cellule
elettricamente eccitabili e a quei fenomeni in
cui è coinvolta la membrana cellulare
Questo corso è propedeutico al corso di
Neurofisiologia cellulare (Prof. Magistretti)
3
Diffusione e flussi Trasporti mediati Equazione
di Nernst Legge di Ohm Potenziale di Membrana
4
Perché parlare del concetto di diffusione?
E una proprietà fisica fondamentale di tutti i
processi biologici
e costituisce il motore tramite il quale le
cellule possono generare segnali
5

• Qualche esempio
• È attraverso flussi diffusionali che molecole
  nutritizie e O2 passano dal sangue alle cellule
  dei vari tessuti.
• Un evento fondamentale che sta alla base del
  funzionamento dei neuroni, la genesi del
  potenziale dazione, è prodotto dalla diffusione
  di ioni Na dentro la cellula nervosa.
• La trasmissione sinaptica, un evento fondamentale
  per la comunicazione neuronale, avviene per
  diffusione del neurotrasmettitore dal teminale
  pre-sinaptico di un neurone al terminale
  post-sinaptico di un altro neurone.
• La conoscenza della velocità di diffusione di un
  farmaco nellorganismo (farmacocinetica) fino al
  raggiungimento delle cellule bersaglio è
  fondamentale per la prescrizione del dosaggio.

6
Che cosa spinge le particelle a diffondere?
La diffusione è il movimento molecolare generato
dallenergia termica moti browniani (A. Einstein)
Che cosè lEnergia Termica?
7
Diffusione di Soluti
Flusso Molare Unidirezionale
Quantità di soluto (in moli) che attraversa
unarea unitaria nellunità di tempo
Dove nno particelle N numero di
Avogadro Aarea Ttempo
8
Il flusso è proporzionale alla pendenza del
gradiente di concentrazione
9
Quali sono le unità di misura del coefficiente di
diffusione (D) ?
mol
3
mol
cm
mol


D
D


2
4
cm
s
cm

2
cm
 

D
s
 
10
Prima Legge di Fick
Il flusso F è direttamente e linearmente
proporzionale al gradiente di concentrazione DC,
e Kd D/Dx
11
Le unità di misura del flusso sono Ammontare di
C per Area per Secondo Dal momento che il
flusso si sviluppa nel tempo, il risultante
movimento di C causa un corrispondente
cambiamento della sua concentrazione nel tempo
12
Seconda legge di Fick il tempo necessario
affinchè ad una certa distanza dalla sorgente
della diffusione, la concentrazione del soluto
raggiunga un determinato livello, cresce col
quadrato della distanza
Per risolvere questequazione differenziale
occorre specificare una condizione iniziale e due
condizioni al contorno, quindi essa ha più
soluzioni diverse,
Condizione iniziale a t0 tutte le No particelle
sono concentrate nellarea (A) Condizioni al
contorno (1.) la concentrazione è finita
ovunque. (2.) il numero totale di particelle
(N0) è costante. allora la soluzione
sarà
Inoltre, essendo
sarà
13
La relaziomne tra concentrazione (C) e distanza
(x) è simmetrica rispetto allorigine per valori
positivi e negativi di x
Ciascuna linea è unistantanea del profilo
spaziale della concentrazione in funzione della
distanza a tempi diversi dalla partenza del
processo diffusivo
Mostra il profilo spaziale della concentrazione
ad un tempo fisso
Si tratta di una curva di Gauss (distribuzione
normale)
Quando il sistema và allequilibrio, la
concentrazione diviene uguale in ogni punto x
(costante)
14
Diffusione attraverso una membrana aspetti
quantitativi
animazioni
Rappresentazione grafica del processo di
diffusione
15
Prima legge di Fick della diffusione attraverso
una membrana
Assumiamo - Vi e Vo sono costanti - i bagni sono
ben mescolati - vale il principio di
conservazione della materia e la membrana è
sottile ciVicoVoN - la membrana si trova
sempre allo stato stazionario FP(ci-co)
(Pperm. della membr. al soluto)
16
Diffusione attraverso una membrana la
concentrazione di soluto varia nel tempo con un
andamento esponenziale
Est. (o)
Int. (i)
ceq110
t
17
Una membrana costituita da un puro bilayer
fosfolipidico è impermeabile alle proteine, alla
maggior parte delle piccole molecole e agli ioni
18
Passaggio attraverso la membrana di particelle
mediante proteine di trasporto
19
Caratteristiche dei trasporti mediati

• I carriers sono dotati di specificità
• Sono soggetti a saturazione
• Possono essere bloccati dagli inibitori
  competitivi
• Hanno unelevata dipendenza termica e dal pH

20
I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi

• I carriers agiscono cataliticamente come gli
  enzimi
• Legano selettivamente il loro substrato, cioè
  la
• molecola che deve essere trasportata
• Cambiano di conformazione per rilasciare il
• substrato dallaltro lato
• Ritornano alla conformazione originale per
  legare
• unaltra molecola di substrato
• Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

21
Analisi cinetica del transporto di una molecola
tramite proteina carrier saturazione
In base alla Ia legge di Fick il flusso di
particelle che diffondono liberamente aumenta
linearmente allaumentare della concentrazione
Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata
se si tratta di un flusso di particelle
attraverso la membrana mediato da carriers
I flussi mediati da carriers -a differenza della
diffusione libera - sono saturanti

• Ciò accade per due motivi
• Sulla membrana è presente un numero finito di
  carriers
• Ciascun carrier opera ad una velocità finita

22
Rappresentazione del concetto di saturazione con
un esempio numerico
23
Quesito su cui meditare Distruggendo, o bloccando
irreversibilmente con un farmaco la metà dei
carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe
inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?
24
Come sono stati ottenuti i dati del grafico che
illustra come varia il flusso al variare della
concentrazione?
?

1. Si introduce nella provetta il substrato S
   radioattivo ad una concentrazione C1
2. A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, ) si preleva
   un campione dalla provetta e si misura la
   concentrazione di S radioattivo allinterno delle
   cellule del campione

1. Dividendo la velocità v1 per larea della
   membrana si ottiene il primo valore del flusso F1
   riferito alla concentrazione C1 (vedere
   definizione di flusso)

25
Successivamente si introduce in ciascuna
provetta substrato S radioattivo alle altre
concentrazioni C2, C3, C4 . crescenti e si
ripete la stessa procedura descritta
precedentemente
26
I carriers, come gli enzimi, possono essere
soggetti ad inibizione competitiva
27
Come funziona un inibitore competitivo?
solo S
S ltlt Ic
S gtgt Ic
Se si vuole costruire un grafico che rappresenti
un range di concentrazioni molto ampio (alcuni
ordini di grandezza) conviene rappresentare le
concentrazioni in scala logaritmica
28
In presenza di Ic il valore di Fmax non cambia
Varia invece la ka
Calcolo della costante di affinità ka
ka è quel valore di concentrazione del substrato
al quale il flusso è la metà di quello massimo ka
è inversamente proporzionale allaffinità del
carrier per il substrato
29
Quesito del giorno

• Un ricercatore trova che la velocità con cui una
  sostanza è trasportata allinterno di certe
  cellule varia al variare della sua concentrazione
  come illustrato in tabella.
• Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo
  che larea di membrana su cui sono state fatte le
  misure è 310-2 cm2
• Rappresentare graficamente i valori del flusso al
  variare della concentrazione di substrato in due
  grafici distinti ove le concentrazioni sono
  rappresentate rispettivamente in forma lineare e
  logaritmica
• Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.

30
Risposta al quesito
31
(No Transcript)
32
Migrazione in un campo elettrico
Cè un flusso netto di cationi (K) verso il
catodo (polo -) e di anioni (Cl-) verso lanodo
(polo )
33
Una differenza di cariche (?q) ovvero di
potenziale elettrico (?V) ai due capi della
membrana influenza il movimento degli ioni
Quindi, il flusso di particelle cariche dipende
non solo dal gradiente di concentrazione ma anche
dal gradiente elettrico
34
Equazione di Nernst Permette di calcolate il
potenziale di equilibrio di una specie ionica
note le sue concentrazioni allequilibrio a
cavallo della membrana
35
Distribuzione di Maxwell-Boltzmann
E' una legge sperimentale che rappresenta il
numero di particelle Nu che possiedono una certa
energia u, in funzione dell'energia stessa u
cioè ad ogni valore di energia (a una data
temperatura T) corrisponde un numero definito di
particelle con quella energia.
Nu/N
T1
T1 lt T2 lt T3 lt T4
Allaumentare della temperatura, aumenta la
frazione di molecole con energia cinetica
maggiore dellenergia di attivazione, larea
sottesa alla curva, a destra dellenergia di
attivazione, è una misura della frazione di
popolazione di molecole con Ec ? Ea
frazione di molecole aventi energia cinetica u
T2
T3
T4
energia cinetica u
36
Lequazione di Nernst è ricavabile dall equazione
di Boltzmann della meccanica statistica
Equazione di Boltzmann Mette in relazione le
probabilità (frazione) di una particella di
trovarsi nello stato energetico ? o nello stato
energetico ? con le differenze di energia
u2-u1Du tra i due stati
La particella spende il minor tempo nello stato
ad energia maggiore
37
(No Transcript)
38
Quando si applica lequazione di Nernst membrana
permeabile ad almeno una specie ionica ed
impermeabile ad almeno unaltra
Allequilibrio flusso dovuto al gradiente di
conentrazione flusso dovuto al potenziale
elettrico
Si tratta di un equilibrio elettrochimico
Equilibrio di Donnan
39
Equilibrio di Donnan
40
Conseguenze Viene prodotta una differenza di
potenziale transmembranaria ?V stabile nel
tempo La concentrazione totale degli ioni
diffusibili (K e Cl-) è maggiore dal lato dove
si trova lo ione non diffusibile
(Pr-) K2Cl-2gtK1Cl-1
Vi è un aumento di pressione osmotica dal lato
dello ione non diffusibile
41
In tutte le cellule cè una differenza di
potenziale a cavallo del plasmalemma stabile nel
tempo (pot. di riposo)
Potenziali di equilibrio dei vari ioni in alcuni
tipi di cellule
conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 12
0 5 145 110
conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8
140 5 4
pot. di Eq. (mV) -75 55 -66 -102 45 -88 -90
91 -89
  Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellu
la muscolare di Rana   Neurone di Mammifero
 ione K Na Cl- K Na Cl K Na Cl-
42
Domanda molto pertinente visto che il PR si
mantiene costante nel tempo (e così pure le
concentrazioni ioniche), si può dire che a
cavallo della membrana sussiste un equilibrio
elettrochimico ?
La risposta è NO Infatti, il PR non coincide col
potenziale di equilibrio (potenziale di Nernst)
per nessuna delle specie ioniche presenti. A 18C
.
conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 12
0 5 145 110
conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8
140 5 4
pot. di Eq. (mV) -75 55 -66 -102 45 -88 -90
91 -89
RP (mV)   -70   -90   -80
  Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellu
la muscolare di Rana   Neurone di Mammifero
 ione K Na Cl- K Na Cl K Na Cl-
43
Quando si genera un potenziale di diffusione
Si genera quando la membrana è permeabile in
misura diversa alle varie specie ioniche
t1
t2
Il suo raggiungimento comporta Equilibrio
elettrico ma squilibrio elettrochimico Flusso
netto non nullo delle varie specie ioniche Un
potenziale di diffusione non si mantiene
indefinitivamente
44
GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA
Il potenziale di membrana è una conseguenza di
una permanente differenza di concentrazione
ionica ai due capi della membrana

• Questa è prodotta da
• una membrana permeabile in maniera selettiva ma
  con valori diversi di permeabilità a diverse
  specie ioniche (potenziale di diffusione)
• flussi passivi e attivi degli ioni permeanti

45
Equazione di Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) per il
Voltaggio
Se il potenziale di membrana Vm è dovuto ad un
potenziale di diffusione, esso non coinciderà con
nessuno dei potenziali di equilibrio delle specie
ioniche permeanti (Vm ? Ei). In questo caso,
invece dellequazione di Nernst vale la seguente
equazione
che è derivata dallequazione di Nernst-Plank per
i flussi
46
Quesito
In base ai dati indicati in tabella e sapendo che
la membrana è permeabile a Na e K con il seguente
rapporto di permeabilità PK PNa 10 1,
calcolare il potenziale di membrana Vm applicando
lequazione di GHK. Confrontare il valore trovato
con quello che si otterrebbe se PKPNa11.
47
È possibile costruire un modello circuitale
elettrico equivalente della membrana Ciò
semplifica la trattazione dei fenomeni
bioelettrici di membrana
48
A questo punto, però, sarà bene andare a
ripassare le principali leggi che regolano i
circuiti elettrici e i principali elementi
passivi che li costituiscono
49
Definizione di potenziale elettrico A ha un
potenziale elettrico più elevato di B se
connettendo A e B con un conduttore una corrente
positiva fluisce da A a B
50
Il gradiente di concentrazione dellNa è
orientato in modo da mandare cariche positive
nella cellula qualora lNa possa passare
Da un punto di vista elettrico ciò equivale a
dire che esiste una batteria al Na con un
determinato orientamento
Nonostante esista un gradiente di concentrazione
dellNa, cioè una batteria al Na, per il
momento non cè flusso di corrente perché il
canale del Na è per ora chiuso!
Cioè, da un punto di vista circuitale ciò
equivale a dire che per il momento il circuito è
aperto
51
In seguito allapertura del canale selettivo per
il Na vi sarà un flusso di corrente (INa)
generato dal gradiente di concentrazione
dellNa, cioè dalla batteria al sodio ENa
Lintensità del flusso di corrente INa dipenderà,
oltre che dallintensità della batteria al Na
(ENa), anche dalla resistenza che il canale
offrirà al passaggio degli ioni Na

-
La permeabilità del canale nei confronti dello
ione può essere rappresentato da un punto di
vista elettrico con un resistore RNa ovvero con
il suo inverso la conduttanza gNa
52
Pertanto, un canale e il gradiente di
concentrazione dello ione permeante che lo
attraversa possono essere rappresentati da un
punto di vista elettrico come costituiti
rispettivamente da un resistore e da una batteria
in serie
Se sulla membrana esistono più canali ciascuno
selettivo per un certo ione, il circuito
elettrico equivalente sarà del tipo
53
Si è visto che un potenziale di diffusione si
genera quando la membrana è permeabile in misura
diversa ad almeno due specie ioniche, ad es. Na
e K
Daltra parte la membrana plasmatica con il suo
corredo di canali ionici e di ioni diversamente
concentrati ai suoi lati, è assimilabile ad un
conduttore elettrico dotato di batterie e
resistori Nellesempio a lato il circuito simula
una membrana dotata di canali selettivi per K e
Na
E possibile applicare la legge di Ohm ad ogni
maglia del circuito Ii gi(Vm-Ei) dove gi
conduttanza della membrana per lo ione i (Vm-Ei
) d.d.p. elettrochimico che muove lo ione i
(driving force)
Studiando il potenziale di diffusione abbiamo
visto che a un certo istante il flusso di K è
uguale e contrario al flusso di Na, ovvero la
somma delle correnti IK e INa è nulla
equilibrio elettrico ? INa IK 0
54
Quesito del giorno
Trovare
Dati
Vm..
1) ENa55mV EK -90mV gNa22mS gK55mS gCl0
gK..
2) Vm -30mV ENa50mV EK -70mV gNa10mS
gCl0
3) ENa62mV EK -90mV ECl -92mV gNa20mS
gK50mS gCl20 mS
Vm..
55
Risposte
56
Problema In seguito allarrivo di un quanto di
neurotrasmettitore, che attiva un certo numero di
recettori-canale a livello di un terminale
postsinaptico, viene generato un potenziale
postsinaptico di -0.24 mV. Se a livello del
terminale postsinaptico il potenziale di membrana
prima dellarrivo del neurotrasmettitore era di
-80 mV, la conduttanza di un singolo
recettore-canale è di 30 pS, il potenziale di
equilibrio dello ione permeante attraverso il
recettore-canale è di 0 mV e la resistenza
dingresso della cellula a livello del terminale
postsinaptico è di 1MW, stabilire quanti
recettore-canali vengono attivati durante la
genesi di quel potenziale post-sinaptico.
La resistenza dingresso (Ri) di una cellula è la
resistenza complessiva che la membrana offre al
passaggio di corrente, e quindi ad una variazione
del potenziale. Essa è misurabile applicando una
differenza di potenziale nota ai due capi della
cellula e andando a misurare la corrente
transmembranaria, oppure iniettando una corrente
nota nella cellula e andando a misurare la
differenza di potenziale generata ai due capi
della membrana.
57
Soluzione
Dati del problema DVPPS -0.24 mV g 30 pS Vr
-80 mV Veq 0 mV Ri 1 MW
Calcoliamo innanzi tutto la corrente che
attraversa un singolo recettore-canale i
g(Vr-Veq) 3010-12(-8010-3) A -2410-13 A
-2.4 pA
Ricordando che la resistenza dingresso (Ri) di
una cellula è la resistenza complessiva che la
membrana offre al passaggio di corrente, e quindi
ad una variazione del potenziale. Essendo quindi
Ri, secondo la legge di Ohm, uguale al rapporto
tra la differenza di potenziale generata ai due
capi della membrana e la corrente totale che
attraversa la membrana, avremo che DVPPS
ItotRi niRi Dove nnumero di
recettoric-canale e icorrente di singolo
canale e quindi, n DVPPS /(iRi)
-0.2410-3/(-2410-13 1106) 100