Int

1
Intérêts de limmunofluoresence et des méthodes
moléculaires pour le diagnostic de pneumocystose
2
Méthodes par coloration

• MGG
• calcofluor
• Gomori-Grocott
• bleu de toluidine

En particulier avec les prélèvements  pauvres 
expectorations ou patients non sidéens
3
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974

• - 108 ech patients immunodéprimés clinique/radio
  suggérant PCP
• crachats induits ou aspirations tracheales
• IFD Ac obtenus chez le lapin

Clinique et/ou radio Nbre patients avec IFD Nbre patients avec IFD Nbre patients avec IFD
Clinique et/ou radio - total
Très en faveur de PCP 25 10 35
Suggestifs de PCP 8 25 3
Négatifs (contrôles) 3 47 50
4
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974
Histologie (methenamine-silver sur biopsie) Nbre patients avec IFD Nbre patients avec IFD Nbre patients avec IFD
Histologie (methenamine-silver sur biopsie) - total
9 0 9
- 2 4 6
total 11 4 15
5
Immunofluorescence
Lim, Applied microbiology , 1974

• bonne spécificité de la technique pas de
  confusion possible
• gain de sensibilité p/t à la méthode de
  référence de lépoque ?
• (anapath.)

6
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980

• rats immunodéprimés par injections sc de
  cortisone 2/semaines.
• sacrifice de 4 rats toutes les semaines
• biopsie de poumon Gomori-Grocott
• LBA Giemsa et IFI (Ac obtenus chez le lapin)

7
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980
8
Immunofluorescence
Milder, J. Clin. Microbiol. , 1980

• au moins aussi sensible que lhistologie pour le
  diagnostic très précoce de linfection.
• sensibilité très supérieure au Giemsa sur LBA
• pas de problème de spécificité.

9
Immunofluorescence
Procop, J. Clin. Microbiol 2004

• 313 échantillons examinés (LBA ).
• Diff-Quick, Gomori-Grocott, Calcofluor,
  Merifluor White (IFD)
• - echantillon considéré si positif avec 2
  techniques au moins.

technique Sensibilité Spécificité VPP VPN
Diff-Quick 48.4 99.6 96.9 88.0
Calcofluor 73.8 99.6 98.0 93.4
Gomori 76.9 99.2 96.2 94.2
IFD 90.8 94.7 81.9 97.5
10
Immunofluorescence
Wolfson, J. Clin Microbiol, 1990 148 ech double aveugle IFD 100 Giemsa 65
Aslanzadeh, Infection, 1996 168 ech IFD 100 CW 57
Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou  à risque ) IFI 90 DQ 73 Gomori 72 Bleu toluidine 71
Ng J. Clin Microbiol, 1990 163 ech (VIH ou  à risque ) IFD 97 DQ 90
Halford, Cytopathology, 1994 384 ech IFD 86 Gomori-Grocott 66
11
Immunofluorescence
Elvin, BMJ, 1988 (abstract) 25 LBA VIH 43 IS VIH IFI 19 Gomori-Grocott 17 IF gt Gomori
Rigole, Pathol. Biol. 1997 (abstract) 100 LBA ID IFD 72 Gomori-Grocott 68
Tuncer, Scand J Infect Dis. 1998 (abstract) 30 IS ID IF 8 Giemsa et Gomori 4
12
Immunofluorescence
Lautenschlager, J Clin Microbiol, 1996 553 LBA ID IF 86 Gomori-grocott 81
13
Immunofluorescence
Aslanzadeh, Infection, 1996 - 168
prélèvements respiratoires dont 58 VIH - IFD
19 dont 12 crachats, 1 crachat induit et 6 LBA
(100) CFW 11 dont 6 crachats et 5 LBA
(57) Gain de sensibilité avec lIF notamment
pour les expectorations.
14
Immunofluorescence
Cruciani Eur Respir J. 2002 - méta analyse
comparaison de lanalyse dun crachat induit
par rapport au LBA ( gold standard ) chez les
VIH. - colorations 43 IF 67
(plt0.001) LIF est nettement plus sensible pour
les crachats induits (VIH).
15
Immunofluorescence
Kovacs, N. Engl. J. Med. 1988 (abstract)

• 49 crachats induits de patients présentant une
  PCP
• (confirmée a posteriori compte tenu des
  colorations,
• la clinique, lévolution sous traitement)

IFI 92 Bleu de toluidine 80 Diff-Quick
76
16
Immunofluorescence
Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou  à risque ) IFI 90 DQ 73 Gomori 72 Bleu toluidine 71
Evaluation des FP avec lIFI 15 patients
uniquement avec IFI ? 3 patients PCP certaine
(réponse au tt anti-Pj) ? 6 patients
indéterminés ? 6 ont autre cause et nont pas
été traités pour Pj
Evaluation des FN avec toutes les méthodes 77
patients ? 57 Vrais négatifs ? 10 patients
indéterminés ? 10 Faux négatifs (réponse au tt
anti-Pj)
17
Immunofluorescence
Ng J. Clin Microbiol, 1990 182 ech (VIH ou  à risque ) IFI 90 DQ 73 Gomori 72 Bleu toluidine 71
Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN
DQ 72 100 100 69
GMS 75 100 100 72
TBO 74 100 100 71
IFI 80 90 93 74
18
Immunofluorescence
Ng J. Clin Microbiol, 1990 163 ech (VIH ou  à risque ) IFD 97 DQ 90
Méthode Sensibilité Spécificité VPP VPN
DQ 70-100 100-100 100-100 65-100
IFD 72-100 100-96 100-92 69-100
(Crachats induits LBA)
19
Immunofluorescence

• difficulté de conclure en labsence de  gold
  standard 
• IF bonne sensibilité, a priori supérieure à
  celle des techniques de coloration
  classique.
• Permet de  rattraper  certains cas.
• Intéressant en particulier pour les
  expectorationns
• deux techniques sont indispensables.
• ? FN de toutes les techniques
• FP de lIF
• décrite comme plus rapide dexecution (p/t
  Gomori) et surtout plus rapide et plus
  simple à lire.
• pas de problème de spécificité Spécificité des
  Ac monoclonaux, et reconnaissance
   facile  des kystes ?

20
Immunofluorescence
21
PCR
Une capacité de détection supérieure
Dilution des LBA comparaison capacité de
détection x 100 p/t Gomori (Ribes, J Clin
Microbiol, 1997 ) x 1000 p/t IFD (Leigh et all,
J Clin Pathol, 1993)
22
PCR
Une capacité de détection supérieure
Brancart, J Microbiol Methods 2005 (abstract) 53 LBA Giemsa et IFD 8 PCR 24
Arcenas, Diag Microbiol Infect Dis (abstract) 2006 Gain de sensibilité de 21 Spécificité.
Ribes J Clin Microbiol, 1997 129 ech Gomori 37 PCR 60
Caliendo, J Clin Microbiol, 1998 232 ech Crachats induits IF 64 PCR 96
Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995 284 ech Crachats induits Giemsa et GMS 28 PCR 85
23
PCR
Une capacité de détection supérieure
Khan, J Infect, 2000 (abstract) 46 ech IF 2 PCR 11 nPCR 21
Tamburrini J Med Microbiol, 1993 (abstract) 52 LBA IFD 81 PCR 100
24
PCR
Une capacité de détection supérieure
pas toujours
Caliendo, J Clin Microbiol, 1998 232 ech LBA IF et PCR 100
Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995 284 ech LBA Giemsa et GMS 82 PCR 86
25
PCR
Pourquoi PCR pas toujours à 100 ?
Un certain nombre de Faux Neg de la PCR sont
post-traitement. Leigh et all, J Clin Pathol,
1993 Mauvaise extraction de lADN Toutes les
methodes ne se valent pas (Lu, J Clin
Microbiol, 1995) sensibilité de 6 méthodes PCR
100, 100, 57, 60, 33, 23
26
PCR
Une trop grande sensibilité ??
Olsson, Clin Microbiol Infect, 2001 91 ech IF sens 60 spé 97 VPP 88 VPN 86 PCR sens 96 spe 59 VPP 52 VPN 100
27
PCR
Il existe un portage sain
Chez limmunodéprimé 18 (Maskell, Thorax, 2003)
Chez limmunocompétent 12 à 20 (Maskell,
Thorax, 2003 Medrano, Emerg Infect Dis, 2005
Sing, J Clin Microbiol, 2000)
Pas toujours retrouvé 0 (Nevez, Clin Infect
Dis, 2005 Weig, J Clin Microbiol, 1997)
28
PCR
Comment distinguer le portage de linfection par
P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004
173 LBA de patients présentant des signes
évoquant PCP  Gold standard  clinique,
épreuve thérapeutique
sensibilité spécificité VPP VPN
Giemsa Gomori 60 100 100 92
PCR RT PCR 100 85 21 100
29
PCR
Comment distinguer le portage de linfection par
P. jiroveci ?
Flori, J Med Microbiol, 2004
Détermination de la concentration en ADN dans
léchantillon
La PCR en temps réel, en permettant la
quantification de lADN de léchantillon pourrait
permettre un diagnostic biologique fiable .
30
PCR
? Les méthodes moléculaires ne sont pas à lheure
actuelle de bonnes méthodes pour le
diagnostic de la PCP trop de faux
positifs dus à une trop grande capacité de
détection.
? autres utilisation possible épidémio,
screening des patients pouvant bénéficier
dune prophylaxie, suivi de lefficacité du tt