Diapositiva 1

1
ENAS
SeraQuest ANTI SSA
ENA 4 PROF
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
ENA 6 SCREEN I
2
SeraQuest ANTI - SSA
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada
11. Leer la absorvancia a 405 nm

3
SeraQuest ANTI - SSA
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Las muestras diluidas son incubadas con el
  antígeno que esta pegado a los pozos
• Si los Ac anti SSA estan presentes en la
  muestra se uniran al antigeno
• Los residuos de la muestra son eliminados por
  lavado y secado
• Se añade el conjugado (anti IgG marcada con una
  enzima) y se incuba la placa
• Si los Ac anti SSA estan presentes, el
  conjugado se unira al complejo Ag Ac
• Los residuos del conjugado son eliminados por
  lavado y secado
• Finalmente se añade el sustrato y se incuba
• En presencia de la enzima el sustrato da un
  producto final de color amarillo, el cual se lee
  fotometricamente

4
SeraQuest ANTI - SSA
H2SO4
5
ENA - 4 - PROF
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm

6
ENA - 4 - PROF
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los Ac específicos para ENA del suero se unen al
  Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de
  la microplaca
• Se incuba con un Ac anti IgG humano conjugado
  con peroxidasa
• Finalmente se añade el cromogeno 3.3, 5.5
  tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de
  hidrogeno (H2O2)
• Este sustrato dará lugar a un producto soluble de
  color amarillo
• La reacción enzimática se detiene con H2SO4
• La formación del producto se mide a 450 nm
• La concentración de Ac en la muestra es
  proporcional a la absorbancia del producto en la
  reacción

7
ENA - 4 - PROF
H2SO4
8
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
9
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• El InmunoDOT DNA/ENA Autoinmunity Screening Panel
  utiliza una técnica de marcado puntiforme (dot)
  de inmunoensayo (EIA) para la detección de Ac
• Los Ag son dispensados como punteados discretos
  sobre una membrana sólida
• Después de adicionar la muestra al envase de
  reacción, se inserta una cinta de prueba,
  permitiendo que los Ac del paciente reaccionen
  con el Ag de prueba para unirse a la membrana
  sólida de soporte de la cinta
• En la segunda fase, la reacción es aumentada por
  el retiro de materiales unidos inespecíficamente
• Durante la tercera fase los anti Ac humanos
  conjugados con la fosfatasa alcalina se dejan
  reaccionar con los Ac unidos del paciente
• Finalmente, la cinta es transferida a un reactivo
  de sustrato enzimático, el cual reacciona con la
  fosfatasa alcalina unida para producir un
  punteado diferenciado, fácilmente visible

10
InmunoDOT DNA/ENA AUTOINMUNITY SCREENING PANEL
Sustrato Enzimático
11
ENA - 6 - SCREEN I
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm

12
ENA - 6 - SCREEN I
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los Ac específicos para ENA del suero se unen al
  Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de
  la microplaca
• Se incuba con un Ac anti IgG humano conjugado
  con peroxidasa
• Finalmente se añade el cromogeno 3.3, 5.5
  tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de
  hidrogeno (H2O2)
• Este sustrato dará lugar a un producto soluble de
  color amarillo
• La reacción enzimática se detiene con H2SO4
• La formación del producto se mide a 450 nm
• La concentración de Ac en la muestra es
  proporcional a la absorbancia del producto en la
  reacción

13
ENA - 6 - SCREEN I
H2SO4
14
ANTICARDIOLIPINAS
Las anticardiolipinas son Ac que van dirigidos
contra las cardiolipinas, las cuales son un
componente importante de la membrana
mitocondrial. Se presentan en las células
metabólicamente activas del músculo cardíaco y
esquelético.
TÉCNICA
15
ANTICARDIOLIPINAS
QUANTA Lite ACA IgG III
QUANTA Lite ACA IgM III
ANTI CARDIOLIPIN ANTIBODI
16
QUANTA Lite ACA IgG III
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm

17
QUANTA Lite ACA IgG III
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los pocillos de la microplaca contienen Ag
  cardiolipina altamente purificado que se ha unido
  en condiciones que mantienen su estado nativo
• Se añaden controles y muestras convenientemente
  diluidas en pocillos separados, uniéndose durante
  la incubación los Ac anti cardiolipina al Ag
  que los recubre
• El resto de componentes no unidos se eliminan
  durante el lavado y se añade conjugado anti IgG
  humana a cada pocillo.
• Un segundo paso de incubación permite que el
  conjugado se una a los Ac presentes
• Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante,
  se añade un sustrato cromogénico y tras
  incubación la actividad enzimática presente en el
  pocillo es proporcional a la intensidad de color
  desarrollado
• Una vez que se haya detenida la producción
  enzimática de producto coloreado, se determina la
  presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina
  por medio de la comparación de la densidad óptica
  de la muestra con la de una curva de calibración
  de cinco puntos.
• Los resultados se dan a conocer de forma
  semicuantitativa en unidades estándar de
  anticardiolipina IgG (GPL)

18
QUANTA Lite ACA IgG III
H2SO4
19
QUANTA Lite ACA IgM III
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm

20
QUANTA Lite ACA IgM III
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los pocillos de la microplaca contienen Ag
  cardiolipina altamente purificado que se ha unido
  en condiciones que mantienen su estado nativo
• Se añaden controles y muestras convenientemente
  diluidas en pocillos separados, uniéndose durante
  la incubación los Ac anti cardiolipina al Ag
  que los recubre
• El resto de componentes no unidos se eliminan
  durante el lavado y se añade conjugado anti IgM
  humana a cada pocillo.
• Un segundo paso de incubación permite que el
  conjugado se una a los Ac presentes
• Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante,
  se añade un sustrato cromogénico y tras
  incubación la actividad enzimática presente en el
  pocillo es proporcional a la intensidad de color
  desarrollado
• Una vez que se haya detenida la producción
  enzimática de producto coloreado, se determina la
  presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina
  por medio de la comparación de la densidad óptica
  de la muestra con la de una curva de calibración
  de cinco puntos.
• Los resultados se dan a conocer de forma
  semicuantitativa en unidades estándar de
  anticardiolipina IgM (MPL)

21
QUANTA Lite ACA IgM III
H2SO4
22
ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
PROCEDIMIENTO

1. Preparar dilución 151 del calibrador, controles
   y muestras
2. Colocar 100 ?l de las diluciones en los pozos,
   reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 ?l de conjugado en los
   pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de
   lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 ?l de sustrato en los
   pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100
    ?l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm

23
ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los Ac anti cardiolipina (ACA) del suero, en
  presencia de ?2 glicoproteína I, se unen a la
  cardiolipina adsorbida a la superficie de los
  pocillos de la microplaca
• A continuación, se incuba con un Ac anti IgG o
  anti IgM humano conjugado con peroxidasa
• Finalmente, se añade el cromógeno 3.3, 5.5
  tetrametilbencidina (TMB)con H2O2, sustrato que
  da color a un producto soluble de color amarillo
• La reacción enzimática se detiene con H2SO4 y la
  formación de producto se mide a 450 nm
• La concentración de Ac en la muestra es
  proporcional a la absorbancia del producto en la
  reacción

24
ANTI - CARDIOLIPIN ANTIBODI
H2SO4
25
TÉCNICA
ANAS

• Los Ac antinucleares (ANAS) constituyen un
  conjunto de distintos Ac dirigidos contra
  componentes macromoleculares normales del núcleo
  celular
• 5 grupos de ANAS
• Ac antinucleoproteínas (complejo DNA - histonas)
• Ac contra DNA
• Ac contra Ag nucleares salino extraíbles
  dirigidos contra los Ag
• Sm (proteína nuclear no asociada con Ag
  nucleicos) RNP
  (ribonucleoproteína)
  
  SS A/Ro
  
  SS B/La
  
  Jo 1
  
  
  Scl 70
• Ac contra ácido ribonucleico del nucleolo
• Ac contra histonas libres

26
ANAS
NOVA Lite ANA Plus
NOVA Lite HEp - 2
27
NOVA Lite ANA Plus
PROCEDIMIENTO

1. Atemperar los reactivos y las muestras a
   temperatura ambiente
2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida
   o de los Controles en los pocillos del
   portaobjetos (A), procurando cubrirlo
   perfectamente
3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante
   30 minutos a temperatura ambiente
4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el
   portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la
   mezcla de sueros.
5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos
   lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino)
6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta
   con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y
   repetir el lavado.
7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando
   el papel secante suministrado. El sustrato debe
   permanecer siempre húmedo.
8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo.
   Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e
   incubar a temperatura ambiente durante 30
   minutos.
9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).
10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el
    portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando
    evitar la formación de burbujas de aire.
11. Observar al microscopio de fluorescencia

28
NOVA Lite ANA Plus
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se
  unen a sus correspondientes antígenos
• Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de
  manifiesto mediante la incubación con un
  anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas
  conjugado con fluoresceína
• Se visualizan por microscopía de fluorescencia
• Muestras con autoanticuerpos exhiben una
  fluorescencia verde manzana correspondiente a las
  áreas de la célula o el núcleo donde el
  autoanticuerpo se ha unido

29
NOVA Lite ANA Plus
30
NOVA Lite HEp - 2
PROCEDIMIENTO

1. Atemperar los reactivos y las muestras a
   temperatura ambiente
2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida
   o de los Controles en los pocillos del
   portaobjetos (A), procurando cubrirlo
   perfectamente
3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante
   30 minutos a temperatura ambiente
4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el
   portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la
   mezcla de sueros.
5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos
   lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino)
6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta
   con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y
   repetir el lavado.
7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando
   el papel secante suministrado. El sustrato debe
   permanecer siempre húmedo.
8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo.
   Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e
   incubar a temperatura ambiente durante 30
   minutos.
9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).
10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el
    portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando
    evitar la formación de burbujas de aire.
11. Observar al microscopio de fluorescencia

31
NOVA Lite HEp - 2
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se
  unen a sus correspondientes antígenos presentes
  en las células HEp-2
• Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de
  manifiesto mediante la incubación con un
  anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas
  conjugado con fluoresceína
• Se visualizan por microscopía de fluorescencia
• Muestras con autoanticuerpos exhiben una
  fluorescencia verde manzana correspondiente a las
  áreas de la célula o el núcleo donde el
  autoanticuerpo se ha unido

32
NOVA Lite HEp - 2
33
ANTI - DNA
Los Ac anti DNA penetran la célula, reconocen y
se unen al DNA de doble cadena o de cadena
simple. La penetracion de estos Ac pueden alterar
las funciones celulares e inducir la muerte
apoptótica de la célula. Uno de los métodos
utilizados para la detección de los Ac anti DNA
es la IFI sobre el protozoo Crithidia luciliae,
cuyo DNA circular y en formade helice esta
contenido dentro de la mitocindria gigante
desplazado hacia uno de sus polos, llamado
cinetoplasto.
TÉCNICAS
34
ANTI - DNA
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae
ANTI ADNn Colorzyme
Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
PEROXISET ANTI DNA
35
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae
PROCEDIMIENTO

1. Atemperar los reactivos y las muestras a
   temperatura ambiente
2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida
   o de los Controles en los pocillos del
   portaobjetos (A), procurando cubrirlo
   perfectamente
3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante
   30 minutos a temperatura ambiente
4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el
   portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la
   mezcla de sueros.
5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos
   lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino)
6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta
   con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y
   repetir el lavado.
7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando
   el papel secante suministrado. El sustrato debe
   permanecer siempre húmedo.
8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo.
   Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e
   incubar a temperatura ambiente durante 30
   minutos.
9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).
10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el
    portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando
    evitar la formación de burbujas de aire.
11. Observar al microscopio de fluorescencia

36
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Los anticuerpos anti DNA del suero se unen a
  sus correspondientes antígenos
• Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de
  manifiesto mediante la incubación con un
  anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas
  conjugado con fluoresceína
• Se visualizan por microscopía de fluorescencia
• Muestras con autoanticuerpos exhiben una
  fluorescencia verde manzana correspondiente a las
  áreas de la célula o el núcleo donde el
  autoanticuerpo se ha unido

37
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae
38
Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
PROCEDIMIENTO

1. Atemperar los reactivos y las muestras a
   temperatura ambiente
2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida
   o de los Controles en los pocillos del
   portaobjetos (A), procurando cubrirlo
   perfectamente
3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante
   30 minutos a temperatura ambiente
4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el
   portaobjetos y golpeándolo ligeramente. Evitar la
   mezcla de sueros.
5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos
   lavándolo con PBS (Buffer Fosfato Salino)
6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta
   con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y
   repetir el lavado.
7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando
   el papel secante suministrado. El sustrato debe
   permanecer siempre húmedo.
8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo.
   Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda e
   incubar a temperatura ambiente durante 30
   minutos.
9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).
10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el
    portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando
    evitar la formación de burbujas de aire.
11. Observar al microscopio de fluorescencia

39
Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn
PRINCIPIO DE LA PRUEBA

• Las muestras de los pacientes se incuban con un
  sustrato antigénico que permite la unión
  específica de los autoanticuerpos al ADNn del
  cinetoplasto
• Si hay Ac anti ADNn se forma un complejo Ag
  Ac estable
• Tras el lavado para retirar los Ac unidos de
  forma inespecífica, se incuba el sustrato con Ac
  anti- humanos conjugados con fluoresceína
• Si los resultados son positivos se forma un
  complejo estable con tres partes el Ac
  fluorescente unido al Ac anti ADNn humano,
  unido a su vez al Ag anti ADNn
• Este complejo se puede visualizar con la ayuda de
  un microscopio de fluorescencia
• En las muestras positivas, el cinetoplasto o el
  núcleo, o los dos, mostrarán una fluorescencia de
  color verde manzana brillante en el interior de
  los microorganismos Crithidia luciliae.

40
Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn