Lezione 11-12 RT-PCR 17-11-2006

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Lezione 11-12 RT-PCR 17-11-2006
Analisi della trascrizione tramite PCR
Analisi della trascrizione e non determinazione
del PM dei trascritti (Northern) Analisi dei
livelli di trascrizione più fine per la
sensibilità del metodo, se si vedessero tramite
Northern le stesse quantità il Northern sarebbe
più informativo (anche PM)
Ampliconi possibilmente a cavallo di introni,
perché ?
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PCR e RT-PCR
Nella RT-PCR valgono tutte le stesse regole della
PCR, in più ci sono delle differenze dovute alla
trasformazione (retrotrascrizione) del mRNA in
cDNA. Variabili della PCR primers (temp.
Melting omogenea) specificità di
appaiamento assenza di hairpins terminaz.
non coesive condizioni di reazione e
reagenti conc. polimerasi, Mg, tampone,
dNTPs, DNA, primers, temp. e durata dei
cicli Nella RT-PCR si deve retrotrascrivere mRNA
in cDNA
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RT-PCR da RNA
Per RT si intende reverse transcriptase su
templato di RNA Per avere un cDNA (DNA
complementare ad un RNA messaggero) si deve
retrotrascrivere lmRNA cioe farlo diventare
DNA I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA
complementare al loro cromosoma ad RNA tramite
una DNA polimerasi specifica che usa come
templato RNA anziche DNA. Pero sempre con la
sintesi in direzione 5-3come ogni
polimerasi. Lenzima reverse transcriptase o
trascrittasi inversa che si utilizza non e
termoresistente, ma deriva da un retrovirus
eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus,
M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche
altri. Piu recentemente sono state isolate e
clonate delle RT mutanti che resistono a
temperatura piu alta di 37C fino a 60C. Le
tecniche precedenti per lo studio della
trascrizione erano lanalisi Northern e
lisolamento dei cDNA da libraries clonate in
vettori vari.
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La reverse trascrittasi RT
Luso della reverse trascrittasi risale a quando
furono scoperti i meccanismi molecolari con cui i
virus ad RNA si replicavano allinterno delle
cellule infettate. I più utilizzati sono quelli
della Murine Moloney leukemia virus MMLV, Avian
myeloblastosis virus AMV che poi sono stati anche
trasformati per resistere meglio ad alta
temperatura per fare la one step RT-PCR Oltre
alle RT anche le Taq polimerasi sono state
migliorate per efficienza ed affidabilità
(riduzione di errori di sintesi).
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Cosa deve fare la RT
Si deve ottenere il retrotrascritto cioè il cDNA
( DNA complementare all mRNA) Si parte da
estratti di RNA totali o arricchiti per poly (A)
su resina con oligo dT La retrotrascrizione può
avvenire con primers di esanucleotidi random o
con poly T, a seconda della lunghezza dei
trascritti e se si vogliono tutte le regioni
trascritte o sempre a partire dal 3
poliadenilato. RNA è molto instabile e vanno
usati degli inibitori delle Rnasi per evitare che
si degradino. Il cDNA è molto più stabile e si
conserva meglio e più a lungo. Il cDNA si
utilizza per la PCR però cè un solo filamento
complementare al trascritto con senso 5-3
inverso.
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RT-PCR dal II filamento in poi
Accorgimenti e controlli della RT-PCR Prima di
retrotrascrivere il cDNA si tratta lRNA con
DNAse per eliminare ogni traccia di DNA genomico
che potrebbe dare falsi positivi. Ottenuto il
cDNA dalla reverse trascrittasi si passa alla PCR
vera e propria con i primers specifici della
regione del messaggero che vogliamo
amplificare. Come accorgimento si può (si deve
quando è possibile) amplificare un amplicone che
comprende due porzioni di due esoni diversi e
così non si amplifica il frammento di DNA
genomico che è molto più lungo in quanto contiene
lintrone. Naturalmente la lunghezza
dellamplicone è sempre ragionevole e non cè
nessun bisogno di amplificare esoni interi, ma
sequenze intorno alle 500 pb.
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Risultati della ricerca sul sito NCBI
Primo primer IGHC-M F CTT CCC GAC TCC ATC
ACT TTC TCC Vado su NCBI
poi su Blastn seleziono homo sapiens Ottengo
molte sequenze della regione della catena pesante
delle Ig, scelgo la prima (Length1279711) gi6121
6116refNG_001019.4 Homo sapiens
immunoglobulin heavy locus (IGH_at_) on chromosome
14 Features in this part of subject
sequence CDS Score 48.1 bits (24), Expect
9e-05 Identities 24/24 (100), Gaps 0/24
(0) StrandPlus/Plus Query 1
CTTCCCGACTCCATCACTTTCTCC 24
Sbjct 967317
CTTCCCGACTCCATCACTTTCTCC 967340 Secondo primer
IGHC-M R GTG GGA CGA AGA CGC TCA CTT TGG
Prendo la prima sequenza che è la stessa
ottenuta col primo primer Length1279711 gi612161
16refNG_001019.4 Homo sapiens immunoglobulin
heavy locus (IGH_at_) on chromosome 14
Features in this part of subject sequence CDS
Score 48.1 bits (24), Expect 9e-05
Identities 24/24 (100), Gaps 0/24 (0)
StrandPlus/Minus Query 1
GTGGGACGAAGACGCTCACTTTGG 24
Sbjct 967662
GTGGGACGAAGACGCTCACTTTGG 967639 Cerco di
prendere lintero frammento compreso tra i due
primers
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RT-PCR

• analisi della trascrizione
  di un gene o isolamento di un cDNA senza Northern
  blot o screening di una cDNA library.
• La RT-PCR da RNA totale di cellule per
  verificare che sia trascritto quel particolare
  gene. Basta una quantità di RNA molto piccola a
  differenza di un northern dove per ogni corsa ci
  occorrono 2-3 mg di poly A mRNA o 7-10 mg di RNA
  totale. Nel caso di una cDNA library la
  quantitainiziale di RNA e di lavoro eassai
  maggiore.
• RT-PCR classica
• - Primo filamento o con primer di oligo dT o
  random priming con esanucleotidi. - Lenzima
  funziona a 37C mutanti resistono fino a 60C.
• Si retrotrascrive tutto lmRNA o tutto lRNA,
  nel caso in cui i trascritti siano molto lunghi e
  lenzima potrebbe non completare la
  retrotrascrizione a partire dal polyA.
• - DallRNA va eliminato il DNA genomico.
• - Dopo la sintesi del primo filamento di DNA si
  puo far partire una normale PCR, ma si fa un
  trattamento di RNase per eliminare lRNA, gli
  esanucleotidi e loligo dT ci sono protocolli in
  cui si fa ununica reazione perche la
  temperatura della PCR e selettiva e la Taq
  hot-start non si attiva prima di essere portata
  oltre 70C.

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RT-PCR IV
Accorgimento quando si estrae lRNA si deve
evitare il DNA e si puo fare un trattamento di
DNAse, e/o scegliere i primers a cavallo di due
esoni I filamento con rev transcript. a bassa
temp. II filamento con Taq polymerase, I coppia
di primers (sulla sequenza del mRNA). Non si
vede tutto il trascritto, come in un Northern,
non se ne puo valutare il peso, ma solo se quel
frammento e trascritto (cioe se ce quel
mRNA), non si vede lo splicing alternativo
salvo scelta dei primers su esoni
diversi Valgono tutte le cose che si sanno per
la PCR compreso rischio di amplificazioni
aspecifiche, la reazione va messa a punto ogni
volta. A differenza del Northern la buona
amplificazione del frammento (amplicone) puo
dipendere non solo dal fatto che ce molto mRNA,
ma anche dallefficienza della PCR, quindi non e
quantitativa.
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Altre applicazioni della PCR
Mutagenesi (sostituzione di basi, singoli
nucleotidi, o inserzioni e delezioni), uso di
primers modificati. Ricostruzione di un gene
senza il templato (recursive PCR,vedi
articolo) con amplificazioni successive RACE 3
rapid amplific. of cDNA extremities PCR
quantitativa PCR competitiva (costruzione del
competitore per inserzione o delezione) SNPS,
single nucleotides polymorphisms analysis AFLPs,
amplified fragment lenght polymorphisms Screening
di libraries in provetta con colture anziche
su piastra
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R.A.C.E.
Con la RT-PCR si amplifica solo un frammento del
cDNA Se si vuole identificare lintero cDNA e non
si conosce e si vuole evitare lo screening di
una library si può ricorrere alla RACE
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Differenze nella ricerca di 5 o 3 ignoti
3
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AAAAA
mRNA
oligo esa nucleotidi random
5
poly TTTTT
3
cDNA primo filamento prodotto dalla RT (completi
e non)
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3
5
TTT
3
3
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I cDNA ottenuti possono avere estremità diverse a
secondo dellefficienza della RT, e dei primers
usati
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Cerchiamo il 3 sconosciuto
In questo caso si usa un oligo dT per
sintetizzare il cDNA -Prima della RT si può
effettuare una reazione di DNase per eliminare il
DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi
perché contamina l RNA e successivamente il
cDNA -Dopo la reazione di RT si può fare una
reazione di RNase per eliminare RNA
RT reverse transcriptase / trascrittasi inversa