Como a Rea

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Como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), PCR
em tempo real e o Sequenciamento de genes são
ferramentas importantes na investigação
científica e no diagnóstico laboratorial ?
Viveca Giongo Laboratório de Virologia
Molecular, Departamento de Biologia Celular e
Molecular/UFF
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Comparação dos valores de sensibilidade entre os
ensaios imunológicos
3
Parâmetros para validação de um teste sorológico

• Sensibilidade - refere-se à porcentagem de
  resultados positivos pelo teste na população
  doente. Verdadeiros Positivos
• Sensibilidade VP/VPFN
• Especificidade - porcentagem de resultados
  negativos pelo teste em indivíduos não doentes.
  Proporção dos verdadeiros negativos
• Especificidade VN/ VNFP

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A Sorologia sempre funciona ?

• Alguns cuidados IgM representa infecção recente.
  Certo?
• Ela pode permanecer na fase de convalescença
• Não indica portanto infecção recente
• Infecções fulminantes por vírus, infecções com
  risco de evolução maligna necessitam de um
  diagnostico precoce

5
Biologia Molecular
6
Reação em Cadeia da Polimerase
7
Histórico...
Nobel Prize, 1968 Principio da replicação do
DNA
Molecular Structure of Nucleic Acids A Structure
for Deoxyribose Nucleic Acid J. D. WATSON F.
H. C. CRICK Medical Research Council Unit for
the Study of the Molecular Structure of
Biological Systems, Cavendish Laboratory,
Cambridge. April 2 Nature 171, 737-738 (25 April
1953) doi10.1038/171737a
8
(No Transcript)
9
Thermus acquaticus
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297
Vol. 98, No. I Thermus aquaticus gen. n. and sp.
n., a Nonsporulating Extreme Thermophile THOMAS
D. BROCK AND HUDSON FREEZE Department of
Microbiology, Indiana University, Bloomington,
Indiana 47401 The isolation of a new
thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n.
And sp. n., is described. Successful enrichment
requires incubation at 70 to 75 C, and the use of
nutrient media relatively dilute with respect to
the organic components. Strains of T. aquaticus
have been isolated from a variety of thermal
springs in Yellowstone National Park and from a
thermal spring in California. The organism has
also been isolated from man-made thermal
habitats, such as hot tap water, in geographical
locations quite distant from thermal springs.
Isolates of T. Aquaticus are gram-negative
nonsporulating nonmotile rods which frequently
form long filaments at supraoptimal temperatures
or in the stationary phase. The optimum
temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C,
and the minimum about 40 C. The generation time
at the optimum is about 50 min.
10
Quem inventou a PCR
Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em
Química (1993) pelo desenvolvimento de um método
que permite sintetizar, em poucas horas e in
vitro, uma grande quantidade de um determinado
fragmento de DNA Seus estudos em 1985 permitiram
amplificar o DNA
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.,
Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic
amplification of beta-globin genomic sequences
and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific
synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods
Enzymol 155 335-35
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Quais foram as limitações?

• Síntese de oligonucleotideos (primers)
• Purificação de DNA polimerase

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"for contributions to the developments of methods
within DNA-based chemistry for his invention of
the polymerase chain reaction (PCR) method"
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PCR

• Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da
  polimerase)
• Reação enzimática de polimerização de DNA in
  vitro
• É uma reação cíclica na qual os produtos de um
  ciclo são substratos para o ciclo seguinte
• Amplificação de sequências específicas de DNA,
  permitindo sua visualização e/ou análise
  posterior
• É um processo termodinâmico e enzimático

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Reação para amplificação de segmento específico
de DNA

• Exon especifico de um gene humano

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Cópia molecular
Capaz de copiar e multiplicar parte de uma
sentença
TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCTAAGCATTT
CGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGC
TACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGG
ATCACTGAGTACAGTACTAGACTACGTAGCTAGACTAGATGCATAGCTAG
CAGTACTTGCATGACTGACTACGTAGCTAGCCGTTAGCTAACGTAGGTTA
CGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGT
AGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAAC
CACTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTAC
GTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTG
AGTACTGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAA
CTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC
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Quais são as aplicações da PCR?

• Diagnósticos moleculares
• Identificação e isolamento de genes
• Marcadores moleculares
• Expressão gênica
• PCR em tempo real

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Diagnóstico molecular gripe aviária
18
Diagnóstico molecular meningite e penuemonia
bacteriana
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HIV
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Aplicações

• Teste de Identificação de indivíduos

• polimorfismo

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Aplicações expressão gênica e polimorfismo
Polimorfismo p53
MELANOMAS DE MUCOSA ORAL E CUTÂNEOS
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Elementos da PCR
DNA amostra, DNA polimerase, Termociclador
substitui a helicase e DNTP nucleotideos
trifosfatados
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Componentes da Reação DNA (DNAg, DNAc Taq
polimerase Primers Tampão MgCl2 dNTPs
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Qual a importância de oligos Ou primers bem
desenhados?

• Pré requisito para obter sucesso no PCR
• alta eficiência
• maior sensibilidade
• produtos de PCR especificos
• ausência de co-amplificação com DNA genômico

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Avaliação prévia da sequência alvo

• Observar
• significado biológico (mRNA/cDNA x gDNA)
• sequência única
• qualidade da sequência alvo
• evitar regiões não desejadas na sequência alvo

26
(No Transcript)
27
Etapas da PCR
1. Desnaturação 2. Anelamento 3. Extensão
28
Principio da PCR
29
(No Transcript)
30
Termocicladores
31
Amplificação Exponencial
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Ao sair do termociclador a aparência é a mesma
revelação da região amplificada
http//teach.genetics.utah.edu/
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Quantificação do DNA amplificado
Nanodrop (espectofotômetro) ? 260 nm
34
Trabalhando com PCR convencional

• 1. Etapas Pré- PCR
• Coleta da Amostra
• Estabilização
• Extração do Ácido Nucleico
• 2. PCR ou Ciclagem
• Preparo da Reação
• Termociclagem
• 3. Pós-PCR
• Análise em Gel

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Tipos de PCR

• Hot Start
• In situ
• Inverse
• Long
• Multiplex
• Nested
• Competitive
• Touchdown
• Degenerate
• Fast

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Hot Start PCR

• A enzima DNA polimerase pode demonstrar uma
  pequena atividade à temperatura ambiente, durante
  a montagem do experimento
• E isso pode catalisar a extensão da extremidade
  3
• Levando depois a degradação da extremidade 5pois
  a DNA pol possui atividade exonuclease
• Destruindo o primer e o substrato
• Hot Start permite a inibição da atividade da
  polimerase durante o preparo da reação
• A polimerase esta ligada a anticorpos e não
  funciona a temperatura ambiente
• O aumento da temperatura libera os ac monoclonais
  e a reação se inicia

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In situ PCR (ISH)

• Reação de PCR que ocorre dentro da célula numa
  lâmina
• Pode ser realizado em células ou tecidos fixados
• Útil para acompanhar infecções

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Inverse PCR (IPCR)c

• DNA cortado em pequenos fragmentos por enzimas de
  restrição
• Ligação do produto DNA circular
• DNA novamente tratado com enzimas de restrição
  gera produtos com sequencia interna conhecida,
  que pode ser usada na PCR
• PCR é realizada com primers complementares às
  sequências internas conhecidas

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Long PCR

• PCR cuja extensão é mais longa que as PCR
  convencionais (gt 5Kb)
• Enzima amplifica alvos maiores (alta fidelidade!)
• Objetivos
• - Clonagem de cDNA de longos transcritos
• - Mapeamento de sequências
• - PCR de genoma mitocondrial

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Multiplex PCR

• PCR com dois ou mais conjuntos de primers, para
  amplificação de diferentes fragmentos de uma
  mesma amostra
• Objetivos
• - identificação de vários vírus
• - identificação de deleções em genes em doenças
  degenerativas (Distrofia muscular de Duchenne)

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Nested PCR

• É uma variação da PCR convencional, na qual são
  utilizados dois paraes de primers (ao i nvés de
  um) para amplificar um mesmo fragmento
• Duas PCR primeira com a fita parental, em
  seguida em uma segunda PCR com a fita menor
• Aumenta a especificidade!

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Competitive PCR

• É adicionada a reação uma quantidade conhecida de
  um fragmento de DNA (competidor)
• Esse competidor deve conter sequências para os
  mesmos primers utilizados para amplificar o alvo
• Quantidade de Dna alvo pode ser derterminada pela
  razão Alvo (T) / competidor (C)

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Touchdown PCR

• Modificação da PCR convencional que pode resultar
  na diminuição de amplificações não especificas
• Temperatura de anelamento
• - começa mais alta que e temperatura ótima dos
  primers
• - diminuição de 1C a cada um ou dois ciclos, até
  atingir a temperatura específica
• - após atingir essa temperatura ela é mantida
  nos ciclos restantes
• Objetivo
• Aumentar a especificidade, evita amplificação
  errônea
• 95C 30s
• 95C 30s, 60C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
• 95C 30s, 56 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
• 95C 30s, 53 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
• 95C 30s, 50 C 30 s, 72 C 1min (25 ciclos)
• 72C 5 min

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Degenerate PCR

• O que são primers degenerados?
• Primers que possuem um numero de opções em várias
  posições na sequência
• Exemplo
• 5- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3
• ACG V
• CT Y
• ACGT N
• Objetivo avaliar polimorfismo

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Fast PCR

• Kits específicos (ex. GeneAmp Fast PCR Master
  Mix)
• PCR pode ser realizado de forma mais rápida, para
  algumas aplicações, tais como
• - genotipagem de animais transgênicos
• - PCR de colônia

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Limitações da PCR convencional

• Intensa padronização
• Baixa sensibilidade e resolução
• Curta extensão dinâmica (lt 2 logs)
• Colorações não quantitativas
• Contaminação (brometo)
• Discriminação baseada soemnte no tamanho do
  amplicon
• Não automatizado
• Necessidade de pós processamento do produto da
  PCR

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(No Transcript)
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Real-time PCR with the SYBR Green I dye.
O corante torna-se fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga a dupla fita de DNA
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Real-time PCR with TaqMan primers
O corante torna-se fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga a dupla fita de DNA
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HR-1TM Melt Curve
A única curva isolada ilustra um declínio mais
rápido da fluorescência,indicando uma mutação que
pode ter interrompido o pareamento de bases de
nucleotídeos do DNA
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Sequenciamento de genes um único primer
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Sequenciamento de genes - elucidação de genoma
http//www.ncbi.nlm.nih.gov
53
http//www.youtube.com/watch?vgNNI19l1LW8feature
player_detailpage
Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço
da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da
Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química
pelo desenvolvimento de um método que permite
sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma
grande quantidade de um determinado fragmento de
DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna
biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme
progresso a áreas como o diagnóstico de doenças,
medicina forense entre muitas outras para além da
Investigação em Biologia.
Kary Mullins ganhou o prêmio Nobel de química em
1993 por desenvolver o famoso PCR, Reação em
Cadeia da Polimerase, que é um processo usado
muito em labs de biologia molecular para
multiplicar uma pequena quantidade de DNA em
muito DNA, facilitando nosso trabalh
http//www.youtube.com/watch?vgNNI19l1LW8feature
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