Diapositiva 1

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Métodos espectroscópicos para la caracterización
de macromoléculas biológicas

• Interacción de radiación electromagnética con
  la macromolécula en estudio
• Se usa amplio rango del espectro
  electromagnético (desde radiofrecuencia hasta RX)
• Cada una aporta distinta información estructural

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Regiones útiles en espectroscopía de biopolímeros

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Técnicas espectroscópicas

• ABSORCIÖN (UV-VIS, IR)
• EMISIÓN (fluorescencia)
• DISPERSIÓN ( Raman)
• DIFRACCIÓN ( Rayos X)
• Luz polarizada (dicroismo circular)
• Resonancia (RMN, EPR)

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Absorción en el uv-vis 100 - 400 nm UV
transición electrónica 400 700
nm VISIBLE Absorción en el infrarrojo 700 nm
2.5 µ transición vibracional
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Aplicaciones de la espectroscopía de absorción
uv-vis

• Cualitativa, Identificación de cromóforos por
  el espectro
• A vs ?
• Cuantitativa, medir la concentración del
  cromóforo
• A? e? b C

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• Las proteínas absorben en el uv-vis?

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ABSORBANCIA ABSORBANCIA
?max (nm) e (M-1 cm-1)
Triptofano 278 287 5600 4500
Tirosina 275 1400
Fenilalanina 258 200
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Espectro de absorción uv de una proteína,
seroalbúmina bovina (BSA)
Espectro de BSA 0.45 µM en buffer fosfato pH 7.0
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Espectro de absorción uv de seroalbúmina bovina
BSA
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Absorción uv-vis de Proteínas
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Absorción en el uv de residuos aromáticos
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Estimación del coeficiente de absortividad molar
de una proteína
e 280 (M-1 cm-1) 5500 x n(Trp) 1490 x
n(Tyr) 125 x n(SS)
n(Trp) número residuos de triptofano en la
secuencia n(Tyr) número residuos de tirosina
en la secuencia n(SS) número de enlaces
disulfuro en la proteína
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Cambio espectral de la tirosina cuando se
desprotona (pKa 10.9), el máximo de absorción
pasa de 280 nm a 295 nm
Titulación espectrofotométrica de Ribonucleasa
pancréatica bovina
RNasa tiene 6 residuos de tirosina
Espectro uv de la RNasa en función del pH
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Cambio espectral de la tirosina cuando se
desprotona (pKa 10.9), el máximo de absorción
pasa de 280 nm a 295 nm
RNasa tiene 6 residuos de tirosina. El resultado
muestra que unas 3 tirosinas se titulan
reversiblemente con un pKa 10.2 Las otras 3
tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH más
elevado que provoca la desnaturalzicación de la
proteína
Absorción a 295 nm en función del pH
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(No Transcript)
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Los ácidos nucleicos, absorben en el uv-vis?
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Absorción en el UV lejano de los ácidos nucleicos
Cromóforo, responsable de la absorción, las bases
nitrogenadas
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(No Transcript)
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Diferencias en estructura secundaria, afecta el
espectro de absorción uv?
Cuando tenemos más de un grupo que absorbe La
orientación relativa de los cromóforos y las
interacciones entre cromóforos, afecta la energía
e intensidad de la absorción
Polipéptido con estructura ovillo estadístico,
es el espectro de una amida (?). Polipéptido con
estructura a-hélice () que tiene grupos amida
orientados y que interaccionan unos con otros, el
espectro cambia banda a 195 nm menos intensa y
hombro a 205 nm
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Seguir la desnaturalización de la proteína por
cambios en la absorción uv
Inserto Espectro de absorción uv de RNasa nativa
y desnaturalizada (8 M urea) Espectro diferencial
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Seguir la desnaturalización de la proteína por
cambios en la absorción uv
Cambios de absorción de RNase a 286 nm y 292 nm
al aumentar la temperatura
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Cuando tenemos más de un grupo que absorbe La
orientación relativa de los cromóforos y las
interacciones entre cromóforos, afecta la energía
e intensidad de la absorción
Espectro de absorción uv de ADN de doble cadena
(línea sólida), ADN cadena simple (línea de
trazos) y tras hidrólisis hasta obtener
nucleótidos libres (línea punteada). Todos los
espectros a igual concentración de bases.
HIPOCROMISMO
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Aplicación del efecto hipocrómico para seguir
desnaturalización de ADN
Al perder estructura secundaria, los residuos
nucleotídicos pierden rigidez, se desordenan,
entonces la intensidad de absorción a 260 nm
aumenta (se pierde efecto hipocrómico). Se
determina Tm (temperatura a la cual la mitad de
ADN se desnaturalizó)
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Cambios espectrales por perturbación del solvente

1. Triptofano (N-acetil éster)(a),Tirosina (b),
   Fenilalanina (c) en agua (línea sólida) o en
   20DMSO (línea punteada)
2. Espectros diferenciales

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Aplicaciones espectroscopía de absorción uv-vis

• Identificación
• Cuantificación
• Cinética
• Determinación de parámetros estructurales
• desnaturalización
• ubicación de residuos
• ionización de residuos
• asociación con ligandos