BIOCONTROLLO Agenti Patogeni degli Insetti Applicazioni biotecnologiche

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BIOCONTROLLOAgenti Patogeni degli Insetti
Applicazioni biotecnologiche
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Il Biocontrollo
È il controllo demografico degli organismi
dannosi realizzato con limpiego di organismi
utili o di loro prodotti nel rispetto della
biodiversità e con il fine di proteggere le
colture.

• Biocontrollo naturale esercitato dai regolatori
  demografici senza alcun intervento delluomo.
• Biocontrollo conservativo manipolazione
  dellambiente o impiego di pratiche agronomiche
  per proteggere o rafforzare I regolatori
  demografici (es. Aree di compensazione - aree
  rifugio).
• Biocontrollo accrescitivo incremento,
  quantitativo e/o qualitativo,della popolazione
  dei regolatori demografici appositamente allevati
  e liberati nellambiente (tecnica inoculativa e
  inondativa, coinvolge insettari e biofabbriche).
• Biocontrollo associativo introduzione di un
  regolatore demografico in un nuovo areale per
  ricostituire con lorganismo dannoso,
  accidentalmente importato, unassociazione
  trofica vantaggiosa, o costituire una nuova
  associazione con regolatore di diverso ospite.
• Biocontrollo integrato abbinamento di diverse
  strategie.
• Le piante migliorate geneticamente (incluse
  quelle transgeniche) La loro sostenibilità deve
  essere meglio valutata.
• I prodotti naturali sostanze derivanti da
  meccanismi di difesa diretta e indiretta delle
  piante, inclusi I geni che le codificano.
• Gli insetti transgenici impiego ancora
  limitato, es. Autocidio realizzato con geni
  letali.
• Biocontrollo per autocidio include la tecnica
  classica dellinsetto sterile (STI) e quella del
  biocontrollo per autocidio.

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Luso degli agenti patogeni nel controllo
biologico

• Gli Invertebrati, ivi compresi Artropodi e
  Insetti, sono soggetti a malattie, come tutti gli
  organismi viventi
• La malattia è una condizione in cui uno stato di
  equilibrio di un organismo con il suo ambiente
  viene alterato
• Gli agenti patogeni sono i responsabili della
  malattia
• Gli agenti patogeni entrano nel corpo dellospite
  o passivamente, con lalimentazione, o
  attivamente, attraverso le aperture naturali o
  penetrando direttamente attraverso la cuticola
• Una volta allinterno dellinsetto, i patogeni si
  moltiplicano rapidamente, uccidendo lospite
  anche con la produzione di sostanze tossiche
• La maggior parte degli agenti patogeni è
  caratterizzata da unalta specificità verso
  lospite e alcuni di essi, in particolare i
  Virus, possono infettare gli insetti di un solo
  genere o di una sola specie
• Epizooziologia dipende dal trinomio
  ospite-agente patogeno-ambiente

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Alcuni dati comparativi sulla biologia dei
principali agenti patogeni degli insetti
Virus Batteri Funghi Protozoi Nematodi
Ospiti bersaglio Lepidotteri ed Imenotteri. Elevata specificità Lepidotteri, Coleotteri e Ditteri. Spec. della sottosp. Molti Ceppi specifici Molti Specifici a livello di famiglia Molti
Modalità dazione Ingestione Ingestione Per contatto attraverso la cuticola Ingestione Attraverso aperture naturali o cuticola
Rapidità delleffetto 3-10 giorni tempi più lunghi per Oryctes virus 30 min - 1 giorno 4-7 giorni Malattia cronica più che letale 1-5 giorni
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Controllo microbiologico e Patologia degli Insetti

• Agostino Bassi la Patologia degli Insetti
  diventa una scienza sperimentale
• Dimostra (1835) che il mal del segno del Baco
  da seta è causato da un microrganismo, il micete
  Beauveria bassiana
• Louis Pasteur negli anni 1870
• Studia due malattie del Baco da seta, una virale
  e laltra causata da un protozoo
• 1878 la prima esperienza significativa di Lotta
  microbiologica ad opera del russo Metchnikov
• il fungo Metarhizium anisopliae viene utilizzato
  per controllare un fitofago del frumento,
  Anisoplia austriaca.

• Applicazioni di virus
• 1893 prima applicazione di Virus contro
  Lymantria dispar in Ungheria raccogliendo larve
  malate, macinandole e usandole per il trattamento
  
• Applicazioni di batteri
• Berliner (1911) Bacillus thuringiensis
• Glaser (negli anni 30)
• Prime sperimentazioni di campo con nematodi
  entomoparassiti, Neoaplectana glaseri, contro lo
  Scarabeide Popillia japonica
• Dal 1965 la Patologia degli Insetti è parte
  integrante della Organizzazione Internazionale
  per il Controllo Biologico

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I Virus

• Forme delle particelle virali (virioni)
  caratteristiche dei diversi gruppi
• Classificati come Famiglie o Gruppi
• Almeno 13 Famiglie annoverano patogeni di
  invertebrati
• I Virus entomopatogeni
• Baculoviridae, Poxviridae, Reoviridae,
  Iridoviridae, Parvoviridae, Polydnaviridae,
  Ascovirus, Birnaviridae, Rhabdoviridae, etc.

• Entità submicroscopiche
• Patogeni endocellulari obbligati
• Struttura Nucleocapside
• Genoma virale (DNA o RNA)
• Capside
• capsula proteica che racchiude gli acidi nucleici

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CPV

• Linfezione virale debilita lospite
• Crescita stentata, movimenti lenti, maggiore
  esposizione verso i predatori, cambiamenti
  emolinfa
• Insetti non gregari si raggruppano allestremità
  di rami
• Alterazioni cromatiche verso tonalità più chiare
• Larve flaccide a V rovesciato
• Inizio infezione morte dellinsetto da 2-3
  giorni fino a 2-3 settimane, in relazione alla
  virulenza del ceppo
• Questa lentezza dazione ne ha limitato luso
  finora alle sole aree forestali

sintomi
NPV
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come agiscono i virus

• Ingestione di corpi di occlusione
• Il pH alcalino dellintestino dissolve la matrice
  proteica del corpo di occlusione, liberando i
  virioni
• I virioni attaccano le cellule epiteliali
  dellintestino e si portano nel nucleo
• Il genoma del virus si moltiplica nel nucleo
  cellulare per poi attaccare le cellule vicine
• Passaggio nellemolinfa e diffusione
  dellinfezione in tutto il corpo
• Dispersione dei poliedri dopo la morte
  dellinsetto per rottura del tegumento

I baculovirus

• Il principale gruppo di Virus usato nella lotta
  microbiologica
• Specifici
• Innocui per vertebrati e piante
• Impatto ambientale bassissimo

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baculovirus GM
Baculovirus ricombinante

• Aumento di stabilità e velocità dazione
• Virus ricombinanti Piretroidi
• Inserimento di tossine provenienti dallo
  scorpione algerino (Androctonus australis), dallo
  scorpione giallo (Leirus quinquestriatus
  hebraeus), e dallacaro Pyemotes tritici
• Inserimento di ormoni o enzimi coinvolti nella
  muta

• I baculovirus sono fotolabili (la luce è il
  principale responsabile di inattivazione

• Dubbi sui rischi potenziali dovuti allaccumulo
  di questi virus GM una volta rilasciati
  nellambiente

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situazione in Italia

• Isolamento e identificazione di Virus da fitofagi
  malati (Magnoler, Triggiani, Marani,
  Cavalcaselle, Deseö)
• Pochi lavori sperimentali, soprattutto in campo
  forestale
• Pochi formulati commerciali disponibili
• Madex, a base di Granulovirus, utilizzato su
  Carpocapsa del melo, distribuito da ItrachemBio e
  Isagro
• Alcuni in fase di registrazione (es. Spodoptera
  exigua NPV)
• Mancanza di centri di produzione
• Scarsa informazione e mercato ridotto

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I Batteri

• Famiglie più importanti
• Bacillaceae
• Enterobacteriaceae
• Bacillus spp.
• Infettano principalmente stadi larvali di
  fitofagi
• Sintomi riduzione del turgore dellospite
  infettato disfunzioni dellapparato digerente
  (con vomito e diarrea) cambio di colore

• Procarioti unicellulari
• Sono ubiquitari
• Mancano di un vero nucleo e di mitocondri
• Si riproducono per scissione binaria
• Sporigeni e asporigeni
• Patogeni obbligati o facoltativi (saprofiti o
  simbionti)

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il Bacillus thuringiensis (Bt)

• Sporeine (1938) primo formulato commerciale a
  base di Bt, in Francia
• Anni 50 -60 le ricerche di Steinhaus
  rilanciano linteresse sul Bt e sui preparati
  microbiologici
• 1957 compare il Thuricide, ancora oggi in
  commercio

• E lagente patogeno più diffuso ed utilizzato
• 1911 Berliner isola in Thuringia (Germania) un
  batterio simile da Anagasta kuehniella (Bacillus
  thuringiensis)

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ciclo biologico del Bt

• Batterio ubiquitario, patogeno facoltativo,
  aerobio e sporigeno
• Ciclo vitale con 2 fasi di crescita Fase
  vegetativa (con abbondanza di nutrienti e una
  crescita esponenziale) e Sporulazione (nutrimento
  scarsamente disponibile)
• la sporulazione produce, oltre alla spora, un
  corpo parasporale con 1 o più inclusioni
  cristalline sintetizzate nella cellula madre
  contenenti proteine (95) e carboidrati (5).
  Questi cristalli proteici hanno proprietà
  insetticide e sono detti tossine-Bt,
  d-endotossine o ICPs (Insecticidal Crystal
  Proteins).

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• Agisce per ingestione
• Nellintestino, in condizioni di pH particolari
  (alcalino nel caso dei lepidotteri, acido nel
  caso dei coleotteri), il cristallo si dissolve e
  la protossina viene attivata
• Le tossine attivate si attaccano a specifici
  recettori presenti sulla membrana intestinale
• Buona parte della specificità delle tossine
  dipende da questi siti di ricezione

Azione del Bt
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Azione del Bt

• Le tossine entrano nelle cellule forando la
  membrana e distruggendone le funzioni
• I fori alterano lequilibrio osmotico della
  cellula
• Le cellule collassano, i microvilli intestinali
  vengono gradatamente riassorbiti con un
  progressivo disfacimento delle pareti
  dellepitelio intestinale
• I batteri si diffondono nel corpo dellinsetto
• Lemolinfa è un ottimo substrato di crescita
• La morte dellinsetto per setticemia sopraggiunge
  nellarco di 1-3 giorni dallinizio dellinfezione

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• d-endotossine
• Ogni sottospecie ne produce un diverso numero
  (una o più) con unazione tossica specifica,
  capace ciascuna di agire su un dato ospite
• Metaboliti secondari con attività insetticida
• A seconda della sottospecie
• ?-esotossine (termostabili)
• ?-esotossine (termolabili)
• Proteine insetticide vegetative -Vips
• presenti nel supernatante del liquido di coltura
  vegetativo
• Non formano cristalli proteici

le tossine prodotte dal Bt
Struttura tridimensionale di una ?-endotossina
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classificazione

• morfologia delle inclusioni parasporali
• Cristalli bipiramidali, cuboidali, sferici,
  irregolari, romboidali
• e classificazione delle ?-endotossine in base
  alle loro proprietà insetticide
• CRY I Lepidotteri
• CRY II Lepidotteri e Ditteri
• CRY III Coleotteri
• CRY IV Ditteri Nematoceri
• Cyt citolisina del Bti

• Le sottospecie di Bt vengono identificate
  mediante test sierologici.
• Più di 40 sierotipi riconosciuti sulla base
  dellantigene H
• Le cellule vegetative del Bt hanno almeno 2
  antigeni sulla loro superficie flagellare (H) e
  somatico (O)

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Bt le sottospecie

• Attualmente circa 60.000 ceppi isolati nel mondo,
  più di 60 sottospecie di Bt identificate, 25 i
  cristalli proteici diversi, più di 200 le tossine
  isolate
• Le sottospecie più importanti
• Bt kurstaki (Btk, ceppo HD-1) isolato nel 1971
  (Lab. Abbott), endospora con 1 o più cristalli
  proteici bipiramidali, attivo, in particolare su
  larve, di più di 100 specie di Lepidotteri
• Sino agli anni 70 si utilizzava il Bt ssp.
  thuringiensis che però produceva anche la
  ?-esotossina successivamente questa sostanza fu
  bandita ed il Bt thuringiensis fu sostituito dal
  Bt kurstaki
• Bt tenebrionis isolato nel 1982 da una pupa di
  T. molitor, attivo su Coleotteri (Crisomelidi,
  Scarabeidi, ma anche Coccinellidi)
• M-One, Trident, Ditera, Novodor

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Bt le sottospecie

• Bt israeliensis (Bti, serotipo H14) isolato nel
  1976, cristallo proteico sferico, produce 4
  tossine, attivo nei confronti di Ditteri Culicidi
  (72 specie), Simulidi, Sciaridi, Chironomidi e
  Tipulidi
• In Africa occidentale migliaia di km di fiumi
  vengono ogni anno trattati con il Bti contro
  Simulium damnosum, vettore di Onchocerca filaria.
• In Germania ed in Cina programmi di controllo
  riusciti contro Culicidi
• Formulati Tekmertec, Vectobac, Bactimos,
  Skeetal
• Alcune delle altre sottospecie canadensis,
  galleriae, morrisoni, aizawai, alesti, kenyae,
  thompsoni, etc.
• La ricerca di nuovi Bt, che è tuttora in corso,
  ha portato in questi ultimi anni allisolamento
  di ceppi attivi contro Imenotteri, Emitteri,
  Mallofagi, Nematodi e Protozoi

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caratteristiche ecologiche

• Il Bt è facilmante biodegradabile in condizioni
  di campo
• Temperatura, acqua, pH, radiazioni solari (in
  special modo gli UV)
• Dopo più di 30 anni di utilizzo su milioni di
  ettari e diversi biotopi non cè stata alcuna
  segnalazione di effetti negativi sullambiente a
  seguito delluso del Bt
• Svariati test di tossicità hanno ripetutamente
  confermato che le tossine sono innocue per luomo
  e gli animali superiori (il basso pH intestinale
  dei mammiferi solubilizza e denatura i cristalli
  proteici). Il Bt è risultato innocuo per uccelli,
  pesci, vertebrati e invertebrati acquatici e
  terrestri, compresa lentomofauna utile
  (parassiti, predatori e impollinatori)
• Unica eccezione per i ceppi che producono la
  ?-esotossina. Meno selettiva delle ?-endotossine,
  nociva per 55 specie di 10 ordini diversi (i.e.
  Pieris brassicae, Musca domestica, Locusta
  migratoria, Apis mellifera) oltre a nematodi
  (Meloydogine) e vertebrati (topi).

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Questi 3 Bacillus appartengono allo stesso gruppo

• Il Bt ed il B. cereus, sono geneticamente e
  fenotipicamente indistinguibili, eccetto che per
  il plasmidio che codifica alla produzione nel Bt
  del corpo parasporale

Arma batteriologica?

• Fanno parte del gruppo anche B. mycoides e B.
  anthracis
• B. cereus è stato riconosciuto responsabile di
  numerose intossicazioni alimentari e infezioni
  oculari

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Tipi di tossine prodotte dal Bacillus
thuringiensis
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• Bacillus sphaericus
• Molto attivo verso larve di zanzare (Culex e
  Anopheles, non su Aedes)
• Cristalli proteici stabili se conservati a 4 C e
  a pH neutro
• Produce 2 tossine, binaria (Btx) e zanzaricida
  (Mtx). I ceppi più virulenti le producono
  entrambe.
• Più persistente del Bti
• Paenibacillus popiliae
• Non produce tossine
• Invade lemocele con le cellule vegetative,
  causando setticemia
• Azione lenta
• Processo di produzione complesso

Altri batteri
Paenibacillus popiliae

• Enterobacteriaceae (batteri asporigeni)
• Serratia entomophila
• Ambra desease su Costelytra zealandica
  (Scarabeidae)
• Serratia marcescens
• Setticemia in Ortotteri

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• Saccharopolyspora spinosa
• Nuova specie di Actinomicete (batteri vicini ai
  funghi), isolata nei Caraibi
• Principio attivo Spinosad
• Metaboliti attivi Spinosine (soprattutto A e D,
  ma se ne conoscono più di 30)
• Naturalyte Nuova classe di agenti di controllo
  (da Natural e metabol-yte)
• Formulati registrati in 60 Paesi su 150 colture.
  Success e Laser
• Ampio spettro dazione
• Tisanotteri (Frankliniella), Lepidotteri
  (Lobesia, Spodoptera, Ostrinia, Plutella),
  Coleotteri (Leptinotarsa), Ditteri (Lyriomiza,
  Ceratitis, Bactrocera, Anopheles)
• Azione per ingestione e per contatto

Spinosad
Non tossico per gli ausiliari (tranne che per
Encarsia e Orius) Basso impatto ambientale .
qualche dubbio .
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produzione, conservazione, distribuzione

• La produzione avviene generalmente in
  fermentatori, in condizioni di buona
  ossigenazione, a 40 C e pH neutro
• Si utilizzano substrati economici
• Esaurito il substrato le cellule entrano nella
  fase di sporulazione
• I prodotti (spore, cristalli proteici e substrato
  non ancora utilizzato) vengono concentrati
  mediante centrifugazione
• I formulati commerciali (granulari, polveri,
  sospensioni acquose o oleose, incapsulati, etc.)
  sono piu di 400 attualmente
• Si conserva per lungo tempo
• Per la distribuzione si possono utilizzare le
  stesse macchine irroratrici dei prodotti chimici
• Importante la valutazione del momento
  dellintervento, della dimensione delle
  goccioline, delle dosi dimpiego e delle
  condizioni climatiche
• Valore di mercato 200 ml

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situazione in Italia

• E di gran lunga lagente patogeno più importante
  e utilizzato
• Mercato in crescita negli ultimi anni, sia in
  campo agrario che forestale
• Importanti le esperienze della Sardegna
• Vi sono ditte produttrici e/o importatrici di
  prodotti a base di Bt
• Un quindicina i formulati commerciali registrati
• Encore (Btk Z52, Xi), Florbac e Xentari (Bt
  aizawai, NC), gli ultimi in ordine di tempo
• Sottospecie più utilizzate Btk, Bt tenebrionis e
  Bt aizawai

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i ceppi modificati geneticamente

• Tra specie (o sottospecie)
• I geni che codificano per più tossine possono
  essere inserite in uno stesso batterio ed agire
  contemporaneamente su più gruppi di insetti
• Introdurre più tossine non equivale però ad
  aumentare la patogenicità, perché viene ridotta
  la quantità di ciscuna tossina. E la patogenicità
  dipende anche dalla quantità di tossina ingerita

• Foil coniugazione tra Btk e Bt tenebrionis e
  agisce su Coleotteri e Lepidotteri
• Cutlass e Condor, Agree e Design tra Btk e
  Bt aizawai
• Novador ottenuto per irraggiamento (raggi
  gamma) del Bt tenebrionis

28
Il Bt nell'ingegneria genetica
Dal 1996 ad oggi sono state poste in commercio
almeno 39 varietà di sementi transgeniche
appartenenti a 12 specie diverse (oltre ai
risaputi soia e mais, anche melone, patata,
pomodoro, radicchio e zucchina), e tantissime
altre sono in attesa di autorizzazione.

• Clonazione dei geni delle tossine Bt in altri
  microrganismi epifiti
• Pseudomonas fluorescens (MPV, Match, M-Peril)
• endofiti
• Clavibacter xyli infetta le piante producendo
  tossine Bt durante la crescita (InCide)
• .. e in piante
• Piante transgeniche

• Piante transgeniche di seconda generazione
• Capacità di sintetizzare più tossine
  contemporaneamente
• Rischi
• Topi e patate GM
• Mais-Bt e farfalla Monarca

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Le piante transeginiche resistenti agli Insetti
Sono state una delle prime applicazioni
biotecnologiche in agricolura. Piante di cotone
esprimenti un gene derivato dal batterio
entomopatogeno Bacillus thuringiensis (Bt) sono
state messe in campo nellestate del 1996 negli
Stati Uniti.

• È comprovata lefficacia di queste piante con
  livelli di attività insetticida notevoli, nei
  confronti soprattutto di Lepidotteri e
  Coleotteri.
• Lelevato livello di espressione insetticida
  nella pianta genera una forte espressione
  selettiva nei confronti delle popolazioni
  naturali di insetti, aumentando la probabilità di
  selezione di ceppi resistenti.
• Per limitare i rischi di fenomeni di resistenza
  da tempo si suggeriscono metodi di coltivazione
  miranti a ridurre la pressione selettiva con il
  ricorso ad aree rifugio o alla semina di genotipi
  resistenti diversi, in una sorta di consociazione
  o rotazione genetica
• Alle strategie di campo si affiancano scelte
  oculate di geni da introdurre nello stesso
  soggetto, cercando di diversificarne le sue
  capacità di resistenza, o ladozione di opportune
  strategie di espressione (alta o bassa),
  scegliendo promotori tessuto-specifici e/o
  inducibili da ferita
• È poi essenziale quantificare limpatto delle
  piante transgeniche su organismi non-target,
  particolarmente insetti utili come impollinatori
  e nemici naturali quali predatori e parassitoidi.

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Geni e Molecole ad attività insetticida di
interesse biotecnologico

• Gli approcci perseguibili per il loro isolamento
  sono riconducibili a due principali alternative
• studio delle basi molecolari delle interazioni
  antagonistiche insetti-altri organismi,
  finalizzato allisolamento delle molecole e dei
  geniche regolano meccanismi di alterazione
  fisiologica negli insetti fitofagi
• b) studio dei meccanismi fisiologici e
  molecolari delle numerose funzioni vitali
  controllate da peptidi ad azione ormonale, al
  fine di cercare di alterare in modo mirato il
  loro titolo e/o metabolismo.

31
Geni e Molecole ad attività insetticida di
interesse biotecnologico

• Lo studio delle interazioni insetti-piante ha
  consentito di definire complessi meccanismi
  coevolutivi che hanno portato allisolamento di
  una cospicua serie di molecole e geni di piante
  in grado di interferire con i processi digestivi
  e di assorbimento dei nutrienti (la pianta
  attaccata dal fitofago è infatti in grado di
  attivare meccanismi di difesa il cui ruolo è
  rallentare lo sviluppo dellerbivoro (es.
  inibitori di proteasi, alfa-amilasi ecc. da
  valutare anche i possibili effetti anche sui
  vertebrati.
• Le simbiosi antagonistiche insetti-artropodi sono
  un ulteriore fonte di molecole ad attività
  insetticida già utilizzate in applicazioni
  biotecnologiche come nel caso delle neurotossine
  isolate da artropodi predatori, scorpioni e
  ragni, o da imenotteri ectoparassitoidi gli
  insetti endoparassitoidi sono invece capaci
  spesso di regolare finemente la fisiologia
  dellospite al fine di favorire lo sviluppo della
  propria progenie le principali alterazioni sono
  a carico del sistema immunitario, endocrino e
  riproduttivo dellospite. Lestrema
  specializzazione dei rapporti simbiotici sono
  garanzia che le molecole e i geni coinvolti sono
  caraterizzati da un buon livello di selettività,
  in quanto derivanti da lunghi processi di
  coevoluzione.
• I virus entomopatogeni possono fornire
  interessanti opportunità molti baculovirus ad
  esempio sono in grado di produrre chitinasi e
  metalloproteasi coinvolte nella degradazione
  della membrana peritrofica e del tegumento
  dellospite
• Lo studio delle basi endorcine dello sviluppo e
  riproduzione degli insetti e dei due principali
  ormoni non-peptidici che le regolano, ecdisone e
  ormone giovanile, ha consentito la produzione di
  nuove molecole insetticide sintetiche (regolatori
  di crescita, chitino-inibitori).

32
Biotecnologie per potenziare e manipolare i
meccanismi di difesa delle piante
Le piante sono continuamente aggredite da agenti
biotici e per potersi proteggere devono mettere
in atto una serie di misure di difesa che siano
in grado di bloccare lattacco esterno con un
costo metabolico ed energetico che non
comprometta la loro vitalità e capacità
riproduttiva

• La difesa diretta delle piante si concretizza con
  linduzione di meccanismi biochimici in grado di
  interferire con lalimentazione, il metabolismo,
  la crescita e la riproduzione dei fitofagi. Molte
  delle molecole implicate inibitori di enzimi
  digestivi, enzimi antinutrizionali, metaboliti
  secondari con attività insetticida sono già
  utilizzate in strategie di controllo.
• La difesa indiretta delle piante deriva dalla
  loro capacità di produrre, in risposta
  allattacco dei fitofagi, specifici metaboliti
  secondari volatili che risultano attrattivi per i
  nemici naturali dei fitofagi che li hanno
  indotti. Il ruolo di questi volatili è quello di
  esaltare la capacità di contenimento naturale dei
  fitofagi, senza passare attraverso fenomeni di
  tossicità diretta. I meccanismi di difesa
  indiretta possono essere esaltati tramite
  miglioramento genetico assistito da marcatori
  molecolari o mediante trasformazione genetica.

33
Impatto degli OGM su organismi non-target
Scienze o emozione?
Sostenitori ed oppositori delle biotecnologie
hanno fatto ampio uso di entrambe. Tuttavia,
lemozione gioca un ruolo determinante
sullopinione pubblica.
34
Scienze o emozione?

• Sostenitori ed oppositori delle biotecnologie
  hanno fatto ampio uso di entrambe.
• Tuttavia, lemozione gioca un ruolo determinante
  sullopinione pubblica.

35
Pubblica Opinione

• la lista dei danni causati da inadeguate
  tecnologie è lunga. Con lingegneria genetica,
  tale lista è destinata ad allungarsi
  ulteriormente. Noi non conosciamo ancora I danni
  potenziali e i rischi associati agli organismi
  geneticamente modificati

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Un pianeta affamato?

• 1,85 miliardi di persone (30) sono affamate
  (FAO, 2002).

37
So What Is The Story?

• Monarch Butterfly, symbol of nature and
  wildness in North America.

38
Incredible Annual Migration!
39
Monarchs Feed on Milkweed(Asclepias tuberosa)
40
Bt Corn Sheds Pollen

• Some of which may fall on milkweed plants that
  serve as hosts for Monarchs.
• Bt corn pollen may contain some quantity of the
  Bt endotoxin.

41
Monarchs Are Killed?

• Scientists have shown that larvae are killed when
  fed milkweed dusted with Bt corn pollen.
• But how realistic was this study?

42
Temporal Spatial Distribution of Monarchs

• Per plant densities of larvae, similar among
  habitats (i.e., ag. vs. non-ag. lands)
• For upper Midwest, most Monarchs are, in fact,
  produced on agricultural lands!
• Regardless of Bt corn, other agricultural
  practices like foliar insecticide use and weed
  control could have large impacts on populations
  of Monarchs

From Oberhauser et al., 2001
43
Corn Pollen Deposits on Milkweed

• Average 171 pollen grains per sq. cm. in corn
  fields
• Average 14 pollen grains per sq. cm. 6 ft outside
  of the corn field
• One rain removes 54-86 of the pollen
• Youngest leaves, the preferred food, have 50-70
  lower pollen density than older leaves

From Pleasants et al., 2001
44
Toxicity of Bt Proteins Corn Pollen
Bt Toxin 1st instars on diet 1st instars on pollen on discs
Cry1F Non-Toxic Non-Toxic
Cry9C Non-Toxic Non-Toxic
Cry1Ac Toxic Non-Toxic
Cry1Ab Toxic Toxic
From Helmich et al., 2001
45
Natural Enemy AbundanceNo Insecticides
P 0.18
P 0.29
Bt cotton Non-Bt
46
Natural Enemy AbundanceInsecticides as needed
Bt cotton Non-Bt
Unsprayed Sprayed
47
Resistenza alle tossine Bt

• 16 specie di insetti reistenti alle tossine Bt
• 14 specie in laboratorio e 2 sole specie, Plodia
  interpunctella e Plutella xiylostella, hanno
  sviluppato una resistenza al Btk in pieno campo
• Nessuna resistenza invece nei Culicidi verso il
  Bti o il B. sphaericus

• Meccanismi di resistenza
• Riduzione della solubilizzazione del cristallo
• Cambio dei recettori delle proteine presenti
  sulla membrana dellintestino
• Prevenzione
• Uso di tossine diverse
• Nel caso di piante GM, uso di piante rifugio
• la resistenza è recessiva

48
Protozoi

• Il Phylum Microspora è il più importante per la
  lotta microbiologica comprende specie parassite
  obbligate di Artropodi. I Microsporidi non sono
  particolarmente virulenti, ma riducono in maniera
  significativa lo sviluppo e la fecondità
  dellospite.
• Le spore, dopo lingestione e la successiva
  germinazione, estrudono un filamento polare,
  capace di penetrare la parete delle cellule
  intestinali ed iniettare al loro interno il
  proprio contenuto cellulare
• Vivono solo in specifici tessuti dellospite
  (corpi grassi, pareti intestinali o organi
  riproduttivi)
• Nosema e Vairimorpha sono i due generi che
  annoverano specie ustate nel controllo biologico.
  N. locustae infetta molte specie di Ortotteri,
  mentre V. necatrix attacca i Lepidoteri

49
Funghi entomopatogeni

• Eucarioti eterotrofi uni o pluricellulari
• Riproduzione per zoospore
• Sessuali e asessuali
• Propagazione per mezzo di conidi

Germinazione di conidi

• Due le classi importanti
• Iphomycetes, caratterizzati cioè dallavere solo
  uno sviluppo vegetativo
• Entomopthorales

Micelio di Beauveria
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• Azione per contatto
• Adesione dei conidi alla cuticola
• Germinazione dei conidi
• vengono attivati da stimoli chimici presenti
  nellepicuticola
• Penetrazione attraverso la cuticola
• Per pressione meccanica e azione chimica tramite
  enzimi digestivi
• Diffusione del micete nellemocele (in circa 24
  ore)
• con produzione di tossine e antibiotici per
  contrastare le difese immunitarie dellospite
• Lospite muore dopo 2 - 7 giorni

Tipico ciclo biologico di un fungo entomopatogeno
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Funghi entomopatogeni in Italia

• Isolamenti da ambienti naturali (esemplari
  infetti e suolo)
• Sperimentazioni di campo con la B. brognartii su
  Scarabeidi
• Alcuni formulati di recente registrazione a base
  di B. bassiana e M. anisopliae

• Alcuni dei Funghi entomopatogeni isolati in
  Italia
• Beauveria bassiana
• B. brognartii
• Metarhizium anisopliae
• Paecilomyces lilacinus
• Penicillium spp.
• Gliocladium roseum
• Scopulariopsis brevicaulis

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I nematodi entomoparassiti

• Nel Phylum Nematoda vi sono molti antagonisti
  degli insetti
• 8 ordini annoverano specie parassite di insetti
• tutti gli insetti possono essere attaccati, in
  tutti gli stadi tranne quello di uovo non si
  conoscono infatti nematodi oofagi.

• Organismi eucarioti vermiformi, lunghi e a
  simmetria bilaterale, rivestiti da una cuticola
  che cambiano durante le mute.

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Uso integrato dei bioinsetticidi

• Significativa riduzione dellimpatto ambientale
• Sinergia con altri prodotti (uso combinato o
  alternato)
• Btk Endosulfan (Dipel8L) Btk Thiocarb
  (Larvin) Btk micotossine di M. anisopliae
  Btk Imidacloprid
• Bti Teflubenzuron Bti Methoprene (Duplex)
  Bti Gambusia, Notonecta
• Baculovirus Piretroidi (per aumentare la
  fotostabilità)
• LAmerican Cyanamid ha già registrato diversi
  prodotti a base di Virus ricombinati
  insetticidi chimici (soprattutto Piretroidi)
• M. anisopliae Teflubenzuron M. anisopliae o B.
  bassiana Imidacloprid
• Imidacloprid, Buprofezin e Nicotina riducono
  linfettività di Steinernema
• Registrazione e commercializzazione
• Prodotti chimici 10-20 ml , 5-8 anni - Prodotti
  biologici 1-2 ml , 1-2 anni (procedura
  semplificata non vengono richiesti esami sulla
  cancerogenesi, sui residui, etc.)

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Tossicità e Impatto ambientale

• Attualmente 2,5 milioni di tonnellate di biocidi
  vengono usati ogni anno nel mondo, per un valore
  di circa 20 miliardi di
• Conseguenze negative delluso dei biocidi per
  lambiente
• Ampio spettro dazione, persistenza
• Insetti secondari possono diventare primari
• Sviluppo di resistenza
• Dati OMS ogni anno nel mondo si verificano 25
  milioni di casi di intossicazione e/o
  avvelenamento da pesticidi, con più di 20.000
  morti.
• Il 99 di questi incidenti (nel 72.5 dei casi si
  tratta di decessi) si verifica nei Paesi in via
  di sviluppo (benché questi Paesi utilizzino solo
  il 25 dei biocidi).

• Il paragone tra questi dati ed i bioinsetticidi è
  del tutto superfluo
• Occorre incentivare luso dei bioinsetticidi e le
  ricerche nel settore del controllo
  microbiologico, soprattutto in Italia