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1
La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II Régule Jun . Découverte des Jun
Kinases IV. Les Kinases de Stress JNK et le
Facteur de Transcription NF-kB . Activation des
JNK, les protéines rac/cdc42 . Stress
Cellulaire, TNF et Facteur de Transcription
NF-kB V. Spécificité de la Voie des MAP
Kinase . Les Problèmes Posés . Les Protéines
Scaffold
2
Etude de la Phosphorylation des Protéines

• Les P-Ser, P-Thr and P-Tyr Résistent à un
  Traitement à lAcide
• Hydrolyse des Protéines avec HCl fortement
  concentré
• Séparation des Acides Aminés par Chromatographie
• Ser, Thr et Tyr Migrent à des Positions Constantes

Control
Stimulation
3
Raf Phosphoryle MEK (MAPK Kinase (MAPKK))
MAPKK
Kyriakis et. al. (1992) Nature 358 417
4
Etude de la Phosphorylation des Protéines

• . Utilisation dAnticorps Reconnaissant les
  Formes Phosphorylées des Protéines

HGF
0
2
5
15
mins
HGFR Phosphorylé
Ex Anticorps Anti-phosphotyrosine Qui
Reconnaissent Uniquement Des protéines
Phosphorylées sur des Tyrosines
117
89
47
IP anti-pTyr
Blot Récepteur HGF
5
(No Transcript)
6
Cell. 1991 Feb 864(3)573-84.
Cell. 1992 Sep 470(5)777-89
7
Thr 231
Ser243
Ser249
8
(No Transcript)
9
Cell. 1992 Sep 470(5)777-89
10
(No Transcript)
11
(No Transcript)
12
(No Transcript)
13
(No Transcript)
14
(No Transcript)
15
(No Transcript)
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
19
Thr 231
Ser243
Ser249
20
(No Transcript)
21
c-Jun est Phosphorylé sur le Domaine
dActivation de la Transcription
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II Régule Jun . Découverte des Jun
Kinases IV. Les Kinases de Stress JNK et le
Facteur de Transcription NF-kB . Activation des
JNK, les protéines rac/cdc42 . Stress
Cellulaire, TNF et Facteur de Transcription
NF-kB V. Spécificité de la Voie des MAP
Kinase . Les Problèmes Posés . Les Protéines
Scaffold
25
Genes Dev. 1993 Nov7(11)2135-48
26
(No Transcript)
27
Ser 63
Ser 73
28
Thr231
Ser243
Ser249
Ser 63
Ser 73
29
Le Décrochage de JNK Active la Transcription
Ser 63
Ser 73
Ser 63
Ser 73
30
Ser 63
Ser 73
31
(No Transcript)
32
Histones Acétylases et Chromatine
HAT
Les Histones AcétylTransférases Permettent
l Ouverture de la Chromatine
33
(No Transcript)
34
(No Transcript)
35
La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II Régule Jun . Découverte des Jun
Kinases IV. Les Kinases de Stress JNK et le
Facteur de Transcription NF-kB . Activation des
JNK, les protéines rac/cdc42 . Stress
Cellulaire, TNF et Facteur de Transcription
NF-kB V. Spécificité de la Voie des MAP
Kinase . Les Problèmes Posés . Les Protéines
Scaffold
36
La Cascade des MAP Kinases
Il Existe Plusieurs Cascades de MAP Kinases
Stress Cellulaire
Jun Kinases (JNK 1/2)
AP1
Apoptose Prolifération
37
La Voie Générique des MAP Kinases
Facteurs de Croissance Stress
MAPKKK (Raf)
La Cascade des MAP Kinases consiste en une Série
de Trois Protéines Kinases, MAPK, MAPK Kinase et
MAPKK Kinase.
MAPKK (Mek, MEK 1-7)
MAPK (Erks, JNKs, p38s)
Cibles (Protéines Cytoplasmiques Facteurs de
Transcription)
Réponse Cellulaire Survie, Prolifération Apoptose
38
Les Voies des MAP Kinases
Voie JNK/SAPK
Voie p38
Voie ERK/MAP kinase
Signaux de Stress
Prolifération/différenciation
Signaux de Stress
Receptor PTK
GRB2/SOS
RAC CDC42
RAS
PAK
RAF1
MEKK1-3
MAPKKK
TAK
MEK1,2
MEK4
MAPKK
MEK3,6
JNK/SAPK
ERK1,2
p38
MAPK
39
Les Kinases de Stress JNKs et p38
TNF-alpha, Interleukine 1, UV Radicaux Libres,
Cassures de lADN
En Réponse à des Signaux De Stress Extra ou
Intra-cellulaires, les JNKs (ou SAPKs pour
Stress-Activated Protein Kinases) sont Activées
en Parallèle de p38
40
Régulation des Kinases de Stress JNKs ou SAPKs
Stress Extracellulaire TNF, etc...
Rac1 CDC42
GTP
PAK
. Rac1 et CDC42 sont Deux Protéines De la Famille
Rho Fixant le GTP . Les Formes GTP Activent la
Sérine/Thréonine Kinase PAK qui Phosphoryle à son
Tour MEKK1-3 . MEKK1-3 Phosphoryle MEK4,
homologue de MEK . MEK4 Phosphoryle JNK/SAPK
MEKK1-3
MEK4
JNK
Stress Intracellulaire (Cassures ADN Radicaux
Libres)
c-JUN
41
La Famille des Protéines GTPases Ras
Ras Rho Rab Arf Ran
Rab1-N
Arf1-6
Ran
H-Ras N-Ras K-Ras TC21 Rap1 Rap2 R-Ras RalA Ra
lB
RhoA RhoB RhoC RhoG RhoE CDC42 Rac1 Rac2
Transport Nucléaire
. Ras est le Membre Fondateur dune Famille de
plus de 70 GTPases . Très conservée les 164
acides aminés du ras humain et poulet ne
diffèrent quà deux positions . La Conservation
Témoigne de Fonctions Essentielles à la Cellule.
Cytosquelette Migration
Prolifération Différenciation
42
Deux Voies dActivation Des MAP Kinases
Mitogènes
Stress
Ras
GTP
Rac1/Cdc42
GTP
Raf
Sos
P
P
PAK
Grb2
P
P
AP1
43
NF-kB et Stress Cellulaire
Production des Anticorps Activation des Cellules
Immunitaires Développement des Lymphocytes T et
B Réponse Anti-Virale Développement
Embryonnaire Contrôle de lApoptose Prolifération
et Différentiation ....
Gènes de l Apoptose Gènes de la Prolifération
Activation de la Transcription
44
La Famille Rel/NF-kB et IkB
45
Le Facteur NF-kB
Le Facteur NF-kB Constitue l Exemple Classique
d Utilisation de L Importine pour Franchir
les Pores Nucléaires
(Inhibiteur)
Passage Pores Nucléaires
46
(No Transcript)
47
(No Transcript)
48
TNF, NF-kB et Stress Cellulaire
TNF
Fixation Récepteur
Recrutement et Activation Du Complexe TRAF/TRADD
Activation Kinase IKKa
Phosphorylation et Dégradation Ik-B
Activation et Translocation NFk-B
Apoptose, Prolifération
Science, 2002 Vol 296, (5573) 1634-1635
49
Les Voies de Signalisation Cellulaire
Voie JNK/SAPK
Voie p38
Voie TNF/NF-kB
Voie ERK/MAP kinase
Signaux de Stress
Signaux de Stress
Prolifération/différenciation
Signaux de Stress
Receptor PTK
RAC CDC42
TRAF
GRB2/SOS
PAK
TRADD
RAS
MEKK1-3
IKK-a
TAK
RAF1
MEK4
IkB
MEK3,6
MEK1,2
JNK/SAPK
NF-kB
p38
ERK1,2
50
La Signalisation Intracellulaire
I. Les Prinicipes de la Signalisation
Intracellulaire . 7 Grandes Voies de
Signalisation . Les Différents Types de
Récepteurs et de Messagers . LesModules
Protéiques . Les Récepteurs à Tyrosine Kinase,
Activation par Dimérisation II. La Cascade des
MAP Kinases . Conservation, Importance
Physiologique et Pathologique . Activation de
erk, Rappel . La Protéine Ras, Modèle des
Protéines dEchange du GTP . Plusieurs Fonction
pour la Protéine Ras III. Régulation de AP1,
Découverte des Kinases de Stress . Rappel sur la
Régulation du Facteur AP1 . Rappel Technique,
Gel Retard et co-Immunoprécipitation . Liaison à
lADN et leucine Zipper, lExemple de AP1, Myc et
CREB . Méthodes dEtude de la Phosphorylation .
Jun est Régulé par Phosphorylation . La Caséine
Kinase II Régule Jun . Découverte des Jun
Kinases IV. Les Kinases de Stress JNK et le
Facteur de Transcription NF-kB . Activation des
JNK, les protéines rac/cdc42 . Stress
Cellulaire, TNF et Facteur de Transcription
NF-kB V. Spécificité de la Voie des MAP
Kinases . Les Problèmes Posés . Les Protéines
Scaffold
51
Spécificité dActivation des MAP Kinases
. Des Mitogènes Activent Fortement la Voie MAPK
classique et pas JNK . Un stress extra ou
intracellulaire Active Fortement la Voie des JNK
et pas la Voie MAPK
Growth Factor
Stress
MAP kinase kinase kinase
. Les voies sont distinctes, pourtant les
protéines sont très similaires et ont des
préférences de substrat in vitro quasi identiques
MAP kinase kinase
MAP kinase
52
Régulation Différentielle des Facteurs de
Transcription Par les voies des MAP Kinases
Mitogènes
Stress
GPCR
RTK
PKC
carbachol
PDGF
TPA
0
20
40
60
20
120
40
60
120
20
40
60
120
time (min)
c-jun
MAPKs
jun-B
c-fos
Facteurs de Transcription
fos-B
mRNA
fra-1
53
LActivation de AP1 par le PDGF Est Médiée par Erk
120
PDGF
80
Activité Transcriptionnelle
40
ERK
JNK
p38
SP
SB
0
U0126
anti-P-ERK
anti- ERK
PDGF
U0126 SP SB











Monje et.al., MCB 2003.
54
Cibles de Ras et Amplification du Signal
Ras est une Molécule Intégatrice . Un seul
Signal dActivation . Plusieurs Effecteurs
Ras
Adenyl cyclase
PI 3 kinase
PKC zeta
Rin
RAl-GEF
Neurofibromin
Rsbs
p120GAP
Raf kinases
RGL
Rho and Rac
55
Les Fonctions de Ras sont Multiples
Ras Ctr
Ctr Ras
actin
Tumor induction
actin depolymerization
Apoptosis
Survie
Prolifération
Cytosquelette
Ctr Ras
Anchorage-independent Growth
Morphologie
Aging
Adhésion
56
(No Transcript)
57
Les Fonctions de Ras sont Multiples
Différenciation Neuronale
PC12
NGF
PC12
PC12
Prolifération
PC12
EGF
PC12
PC12
Les Deux Signaux Activent les MAP Kinases Via
Ras/erk
58
Spécificité dActivation des MAP Kinases
A
B
A'
B'
59
Spécificité dActivation Et Protéines
Adaptatrices
Scaffold Ou Adaptateurs
Deux Interactions
Une Seule Interaction
Substrate
60
Spécificité dActivation Et Protéines
Adaptatrices La Levure
Ste5
Ste11
MAPKKK
Ste 7
MAPKK
Fus 3
MAPK
Recrutement Et Localisation de la Cible Fus3 à
Proximité de sa Kinase Régulatrice
61
Spécificité dActivation Et Protéines
Adaptatrices La Levure
La Même Kinase Est Utilisée mais Elle Est Dirigée
vers des Cibles Différentes par des Protéines
Adaptatrices Spécifiques
62
Spécificité dActivation Et Protéines
Adaptatrices
Le Modèle s Applique aux Eucaryotes Supérieures
Whitmarsh et. al. (1998) Science 281 1671