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LARN Interférence, les Micro-ARNs
IV. L ARN Interférence Co-Suppression chez les
Plantes Inhibition chez le Nématode et ARN
Doubles Brins Un Mécanisme Anti-Viral
? Découverte du Complexe RISC et de la Rnase
Dicer Le Mécanisme de l ARN Interférence Les
Micro-ARN Applications Technologiques
2
Mise en Evidence de lARN Interférence
Mex3
LUtilisation de Séquences dARN Double Brin
Produit Une Extinction Génique Plus Forte (X100)
quavec un Oligo Antisens
Mex3 Mex3 ARN double brin
Mex3 AS Mex3
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver
SE, Mello CC. Potent and specific genetic
interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 Feb
19391(6669)806-11.
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Mise en Evidence de lARN Interférence
ARN Double brin Anti gfp
ARN Double brin Témoin
LInactivation est Stable Et Se Transmet dUne
Cellule à lAutre
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver
SE, Mello CC. Potent and specific genetic
interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 Feb
19391(6669)806-11.
4
Mise en Evidence de lARN Interférence
Animaux Baignés dans un Liquide Contenant Des ARN
Double Brin interférants anti-gfp
Animaux Elevés sur des Bactéries Produisant Des
ARN Double Brin interférants anti-gfp
LInactivation par ARN Interférence est un
Processus Extrêmement Efficace
5
(No Transcript)
6
Quelle Fonction pour lARN Interférence ?
Infection Virale
Génération De Structures Nucléotidiques Anormales
ARN Interférence
Elimination/Inhibition du Matériel Génétique
Etranger
7
LARN Interférence, Protection Anti-Virale
LARN Interférence due aux ARN double brins est
observée dans de nombreuses espèces (Champignons,
Plantes, Poisson Zèbre, Drosophile, Trypanosomes,
Mammifères)
Protection
Le Signal Peut Se Propager (Jonctions)
Diffusion du Signal
Infection Virale
8
LARN Interférence comme Protection Anti-Virale
Les Plantes Utilisent lARN Intérference Comme
Moyen de Défence Anti-Virale (Probablement
Identique pour d Autres Organismes) L1 mock
Arabidopsis Témoin L1 cmv Infection Virus CMV L1
cmv sgs Infection, Arabidopsis Mutant
Mesure de lExpression des ARN viraux Dans des
Plantes de Type Sauvage Ou Mutantes
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LARN Interférence, les Micro-ARNs
IV. L ARN Interférence Co-Suppression chez
les Plantes Inhibition chez le Nématode et ARN
Doubles Brins Un Mécanisme Anti-Viral
? Spécificité de l ARN Interférence Découverte
du Complexe RISC et de la Rnase Dicer Le
Mécanisme de l ARN Interférence Les
Micro-ARN Applications Technologiques
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Mécanisme Moléculaire de LARN Interférence

• Transfection de Cellules Drosophiles avec dsRNA
• Extraction ARN et Northern Blot
• Seuls les ARNm dont la séquence correspond au
  dsRNA sont inhibés

LARN Interférence est Un Mécanisme Spécifique Et
Non Général
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An
RNA-directed nuclease mediates post-transcriptiona
l gene silencing in Drosophila cells.Nature.
2000 Mar 16404(6775)293-6.
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Mécanisme Moléculaire de LARN Interférence
Blocage de la Synthèse des ARNs ?

• Transfection de Cellules Drosophiles avec dsRNA
  Cycline E
• Lysat Cellulaire
• Mise en Présence dARNs Synthétisés in vitro de
  Cycline E ou LacZ (Témoin)

0, 10, 20, 30, 40, et 60 minutes
Mise en Evidence dune Activité Nucléase
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An
RNA-directed nuclease mediates post-transcriptiona
l gene silencing in Drosophila cells.Nature.
2000 Mar 16404(6775)293-6.
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Mécanisme Moléculaire de LARN Interférence

• 1. Transfection de Cellules Drosophiles avec
  dsRNA Cycline E
• 2. Lysat Cellulaire
• 3. Fractionnement sur Résine Echangeuse dIons
• 4. Mise en Présence dARNs Synthétisés in vitro
  de Cycline E ou LacZ (Témoin)

Echantillons Sortant de la Colonne
dsRNA
Mise en Evidence dun Complexe à Activité
Nucléase (RISC) dont la Spécificité est Guidée
par lARN double-brin Homologue au Substrat
LActivité Nucléase Est Associée au dsRNA Dirigé
contre la Cycline E
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An
RNA-directed nuclease mediates post-transcriptiona
l gene silencing in Drosophila cells.Nature.
2000 Mar 16404(6775)293-6.
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Découverte du Complexe RISC
RISC
dsRNA
ARN Cible Dégradé
ARN Cible
Mise en Evidence dun Complexe à Activité
Nucléase (RISC) dont la Spécificité est Guidée
par lARN double-brin Homologue au Substrat
RISC ou RNA-induced Silencing Complex
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An
RNA-directed nuclease mediates post-transcriptiona
l gene silencing in Drosophila cells.Nature.
2000 Mar 16404(6775)293-6.
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Découverte du Complexe RISC Et de la RNAse Dicer
Les ARN double-brin sont Essentiellement Reconnus
par Les RNAses de type III

• Production ARN cycline E
• Mise en Présence Différentes RNAse III
• Recherche de Produits de Dégradation

Seule Dicer Est Capable de Dégrader lARN de La
Cycline E
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ.
Role for a bidentate ribonuclease in the
initiation step of RNA interference. Nature. 2001
Jan 18409(6818)363-6.
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Découverte du Complexe RISC Et de la RNAse Dicer

• Blocage de lExpression de Dicer in Vivo (dsRNA)
• Extrait Cellulaire
• Mesure Activité Nucléase

La Perte de Dicer Diminue lActivité dARN
Interférence De lExtrait
(Casp9dsRNA contrôle)
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ.
Role for a bidentate ribonuclease in the
initiation step of RNA interference. Nature. 2001
Jan 18409(6818)363-6.
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Les Substrats de la RNAse Dicer
RNases de Type III
Dégradation
ARN double-brins viraux
RdRP
ARN Double brin Résultant de la Transcription
Inverse ou de la Transcription sur ARN
microRNA (miRNA, hairpin)
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Le Mécanisme de lARN Interférence
ARN Double Brin
Clivage du Double Brin par Dicer
Génération dun Petit ARN Interférant (siRNA)
Génération dun ARN Simple Brin Au Sein du RISC
et Ciblage par le siRNA (hybridation) Vers lARN
cible à Dégrader
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LARN Interférence comme Protection Anti-Virale
Les siRNAs Diffusent de Cellules à
Cellules Amplification Du Signal
Immunological Reviews Volume 198 Page 285  -
April 2004
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LARN Interférence, les Micro-ARNs
IV. L ARN Interférence Co-Suppression chez
les Plantes Inhibition chez le Nématode et ARN
Doubles Brins Un Mécanisme Anti-Viral
? Spécificité de l ARN Interférence Découverte
du Complexe RISC et de la Rnase Dicer Le
Mécanisme de l ARN Interférence Les
Micro-ARN Applications Technologiques
20
Une Fonction Physiologique Pour lInterférence ?
Linactivation de DICER est Léthale très tôt dans
le Développement LARN Interférence Joue un Rôle
Essentiel dans lEmbryologie
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Découverte de let-7, Gène du Développement ?
Chez C. elegans, des Mutations du Gène let-7
induisent un Blocage de la Maturation
Cellulaire La Surexpression de let-7 Accelère le
Développement vers la Stade Adulte aux Dépends de
Stades Larvaires
Contrôle du Développement et de sa  Cinétique 
Reinhart BJ, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA
regulates developmental timing in Caenorhabditis
elegans. Nature. 2000 Feb 24403(6772)901-6.
22
let-7 est un Nouvel ARN Non Codant

• let-7 ne Code pas Pour une Protéine
• Let-7 Produit un ARN Non Codant de 21 nucléotides
• La Structure de cet ARN Forme une Boucle
• LExpression de let-7 Varie en Fonction du Stade
  de Développement et Apparaît à la Transition
  Larve-Adulte

let-7 mutant
Wild type
?
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Les Micro-ARNs
lin-4 Le Premier miRNA Découvert
miRNA simple Brin Complémentaire du 3UTR de
lin14
Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans
heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with
antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993
Dec 375(5)843-54.
Micro ARN
ARN Cible
24
Les Cibles des Micro-ARN
LARN let-7 est complémentaire de la Partie 3UTR
de lARN lin-41
Micro ARN
ARN Cible
25
Expression de let-7 et LIN-41
LIN41 Est Exprimé pendant les Stades Larvaires
Quand let-7 nest pas Présent
LIN-41 protein
RNA or protein level
let-7 RNA
L1 stage
L2 stage
L3/4 stage
Adult stage
LIN-41 Disparaît avec lExpression de let-7 Pour
Permettre la Transition Stade Larvaire-Age Adulte
26
Les Micro-ARN Sont Produits par Dicer
. LInactivation de Dicer chez C. Elegans Montre
le Même Phénotype que celui des Mutants de
let-7 . LInactivation de Dicer chez C. Elegans
Bloque la Formation de let-7 et lin-4 .
LInactivation Bloque le Passage dun ARN de Haut
Poids Moléculaire à des Formes Plus Courtes
lin-4
Let-7
Pasquinelli AE et al.. Genes and mechanisms
related to RNA interference regulate expression
of the small temporal RNAs that control C.
elegans developmental timing.Cell. 2001 Jul
13106(1)23-34.
27
Mécanisme Moléculaire de lInterférence Par
micro-ARNs
. Dicer Clive le Précurseur Hairpin Pour le
Transformer en un MicroARN Simple Brin de 22
nucléotides . Les miRNA Sont Incorporés dans
le Complexe miRNP(RISC) puis sHybrident à Leurs
ARNs Cibles
28
Production des micro-ARNs
1. Transcription des Gènes des miRNAs
Drosha
2. Maturation par Drosha
200 Décrits Actuellement Chez l Homme
3. Export Cytoplasmique (Drosha, Exportine 5)
29
Production des micro-ARNs
4. Prise en Charge par Dicer (RISC) (Génération
Simple Brin)
5. Hybridation ARN Cible Dans le
RISC (Dégradation, Répression)
200 Décrits Actuellement Chez l Homme
30
Mécanisme de Production des ARN Double Brin Dans
la Cellule
Convergence entre la Technique DARN
Interférence et les microARNs
mRNA degradation
Inhibition of translation
31
RNAi-induced silencing complexes (RISC)
Complex identified in mammalian
cells Gemin3 Gemin4 Ago
Complex identified in Drosophila S2
cells dFRX TSN-1 VIG Ago
All RISC complexes identified to date contain a
protein of the Argonaute family
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LARN Interférence, les Micro-ARNs
IV. L ARN Interférence Co-Suppression chez
les Plantes Inhibition chez le Nématode et ARN
Doubles Brins Un Mécanisme Anti-Viral
? Spécificité de l ARN Interférence Découverte
du Complexe RISC et de la Rnase Dicer Le
Mécanisme de l ARN Interférence Les
Micro-ARN Applications Technologiques
33
Transfection Cellulaire
Plasmid Test
Gène
Promoteur
Transfection
Inactivation de Gènes ?
Etude des Conséquences Physiologiques Spécificité
?
Surexpression de la protéine
34
LARN Interférence au Laboratoire
Génération dun ARN double Brin
Inactivation dun Gène Cible
Mesure des Effets Cellulaires
35
Les Applications de lARN Interférence
36
Les Applications de lARN Interférence

• Synthèse Chimique du RNAi
• Transcription In Vitro puis Hybridation

PromoterT7
PromoterT7
Sequence AntiSens
Sequence Sens
ARN Double Brin
Dicer, RNAi Inactivation Transitoire
Transfection
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LARN Interférence au Laboratoire

• Les Méthodes dIntroduction des ARN double-brin
  (ou de siRNA) Dépendent de lOrganisme
• C.elegans -- injection, bain, ou nourriture
• Cellules de Drosophile -- milieu de culture
• Cellules Mammifères -- Transfection ou
  Electroporation

38
LARN Interférence au Laboratoire
2002 Drug Discovery Today 7(20)1040-1046
39
La Réponse de la Cellule aux ARN Double Brins
L Introduction d ARN Double Brins Mime
l Apparition dun Génome Viral

• Fixation sur les Récepteurs Toll (TLR3)
• Se Fixe sur Des Protéines Contenant des Motifs
  de Liaison aux ARN Double Brin comme PKR ou des
  Protéines de Reconnaissance (RIG)

. Activation de la Production dIFN . Blocage de
la Synthèse Protéique
40
Les Récepteurs Toll
TLR3
Les Récepteurs Toll (TLR) Reconnaissent des
Structures Microbiennes pour Activer Des
Signalisations de Défense. TRL3 Reconnaît les
ARN Double Brin
41
LHélicase RIG-1
RIG-I est une ARN Hélicase qui Répond aux ARN
Double-brin et Active la Production dIFN via
IRF-3 et NF-?B (Enhanceosome).
42
La Protéine Kinase R
Inactivation
Blocage Traduction
Activation de PKR Par des ARN Double Brin
43
LARN Interférence au Laboratoire
Génération de Petits ARNs Interférents
Inactivation dun Gène Cible
Mesure des Effets Cellulaires
Effet Transitoire
44
Mécanisme de Production des ARN Double Brin Dans
la Cellule
Convergence entre la Technique DARN
Interférence et les microARNs
mRNA degradation
Inhibition of translation
45
(No Transcript)
46
Le Vecteur dExpression pSuper
Promoteur H1, Régulé Par la Polymérase
III, Permettant la Synthèse D ARN Double Brin
Cours
Possibilité d Inclure Un Gène de Résistance
47
Les Constructions Clonées dans pSuper
7
9
5
48
Spécificité de lInterférence

• Les Mutants ne Bloquent pas lExpression

49
Inactivation de p53
Western Blot (anti-p53)
50
Transfection Cellulaire
Plasmid Test
Gène
Promoteur
Transfection
Inactivation de Gènes ?
Etude des Conséquences Physiologiques Spécificité
?
Surexpression de la protéine
51
LInactivation par pSuper est Stable
52
LInactivation par pSuper est Stable
48 hrs
2 mo
Western Blot
Northern Blot
53
Utilisation de LARN Interférence In Vivo ?
Infection Virale Avec un Plasmide Codant pour
la Luciférase
CoInfection Avec un siRNA Témoin Ou Dirigé
contre La Luciférase
Administration i.p De D-Luciférine
Imagerie
Extinction de Gènes in vivo ? Ciblage ?
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High-Throughput Functional Analysis
Library of siRNAs (50K)
Collection of siRNAs (1-10K)
1
2
3
1
2
3
Viral particles
Cells
Functional Assay
Functional Assay/Selection
Gene-Phenotype Association Studies Specific
Gene(s)
Novel Gene Analysis

Discovery Multiple samples

All genes
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RNAi cell devision in C. elegans
Gönczy et al. Functional genomic analysis of
cell division in C. elegans using RNAi of genes
on chromosome III. Nature. 2000 408(6810)331-6.
In vivo time-lapse differential interference
contrast microscopeidentification of 133 genes
(6) necess. for distinct cellular processes in
early embryos (most of the genes of CIII that are
required for proper cell devision)47 of the
identified genes have ortholoques in other
eukaryotes