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Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une
approche par contraintes

• Julien Gagneur
• doctorant
• Grenoble, 6 Mai 2004

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Motivation

• On cherche à  explorer différentes approches
  pour l'étude intégrée des réseaux géniques et
  métaboliques 
• On se restreint à une cellule.

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Motivation

• E. coli
• ? 750 réactions
• ? 500 métabolites

Roche Applied Science  Metabolic Pathways  map
4
Motivation

• Le  plan  est complet pour certains
  micro-organismes (H. influenzae, E. coli)
• Par séquençage et annotation de génome, en cours
  pour dautres micro-organismes (KEGG)
• Il existe des modèles des réactions enzymatiques
  (MCA)
• MAIS Il est difficile destimer in vivo
• Les lois cinétiques
• leurs paramètres
• les concentrations des métabolites

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Motivation

• Des données structurelles, certes, mais (presque)
  complètes à léchelle cellulaire
• Que peut-on dire sur le métabolisme à partir du
  réseau seulement ou à partir du réseau et de
  quelques mesures?
• Approche par contraintes

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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

7
Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

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Construction du modèle

• Système
• Métabolites
• Internes m6
• Externes
• Flux (réactions transports) q10
• Stœchiométrie

(Klamt et al, 03)
9
La matrice de stœchiométrie N

• N est un composant essentiel du système dynamique
  
• La dynamique du système est décrite par (MCA)
  

c(t) concentrations r(t) flux des réactions
(reaction rates)
contient les paramètres cinétiques
N invariant du système contient sa structure
N matrice creuse
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Hypothèse détat quasi-stationnaire
Les métabolites ont un temps de turn-over typique
? rapide par rapport à la régulation
Le métabolisme est à létat quasi-stationnaire
(quasi steady-state)

Pour les métabolites internes Production
Consommation
c(t) const.
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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

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Metabolic Flux Analysis
Détermination dune distribution de flux lors
dune expérience à létat stationnaire
L équation Nr 0 est souvent
indéterminée (qgtm plus de réactions que de
métabolites) ? certains flux doivent être
connus par mesures par hypothèses
Soit - k (known) les indices des flux connus -
u (unknown) les indices des flux inconnus
13
Metabolic Flux Analysis
La solution utilisée est basée sur la matrice
pseudo-inverse de Moore-Penrose qui résout le
problème des moindres carrés -pour les cas
sur-déterminé (moindres erreurs) -pour les cas
sous-déterminé (solution parcimonieuse)
14
Metabolic Flux Analysis
Connu inconnu
0
2
Déterminé
B
A
2
Sur-déterminé
Sous- déterminé les flux manquants peuvent être
estimés par - pseudo-inverse (longueur
minimale) - optimisation dautres objectifs
(croissance maximale)
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MFA Utilisation

• Avec les flux externes souvent insuffisant
• Combines avec des mesures (partielles) des flux
  internes
• Isotopic Tracer Experiment

(Wiechert et al.)
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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Premiers pas
• Ce que lon pourrait faire (propositions)

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Irréversibilité de certaines réactions
Certaines réactions, dans les conditions de
fonctionnement de la cellule, sont
unidirectionnelles. Les flux associés sont
positifs ou nuls.
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Construction du modèle (suite)

• Flux (réactions transports) q10
• RevR2,R8
• IrrevR1,R3,R4,R5, R6,R7,R9,R10

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Le cône des états possibles

• Les états possibles obéissent à un ensemble de
  contraintes linéaires
• m égalités
• Irr inégalités
• Cela restreint toute solution
• dans un cône polyédrique convexe

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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

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Flux Balance Analysis
Détermination dune distribution de flux optimale
à létat stationnaire pour une fonction objectif
donnée
On considère un problème doptimisation linéaire

• État stationnaire

Sous contrainte

• réversibilité et capacité

• Exemples
• réaction irréversible ?i0
• flux maximal connu (capacité) biVmax
• conditions du milieu ?i bi0

Problème standard et rapidement résoluble Le
argmax nest pas unique !
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FBA fonction objectif

• Suivant lidée que lévolution a conduit à des
   organismes optimaux 
• croissance maximale (maximal growth)
• rendement dATP
•  metabolic engineering  optimisation
  dorganisme
• rendement maximal pour un certain produit
• Minimisation de produits secondaires

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FBA exemple
Max cTr (0,0,1,0,0,0,0,0,0,0) r
Sous Nr 0 ?i (0,-?,0,0,0,0,0,-?,0,0) ?i
(1,0,?,?,?,?,?,?,?,?)
Rendement optimal R3/R1 1
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FBA application et variante

• Prédiction du taux de croissance optimal (et
  observation !)
• (Edwards et al., Ibarra et al. )
• Identification de rendement optimaux
• (Nielsen et al., Stephanopoulos et al. )
• Prédiction de viabilité de mutants
• (Edwards et al.)
• Invalidation de réseaux
• Une variante pour les mutants
• MoMA Minimization of Metabolic Adjustment
• Le mutant serait à un état sous optimal mais
• voisin de létat optimal de la souche sauvage
• (Segre et al.)
• Simulation dynamique

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FBA Limitations

•  fonction objectif naturelle 
• les organismes sont-ils optimaux?
• Pour quel objectif?
• la solution optimale nest pas unique!

• Pas de prédiction certaine de la distribution
  des flux

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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

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Metabolic Pathway Analysis
Définition de la notion de  voie métabolique 
comme route fondamentale fonctionnelle a
léquilibre.
Lidée part du cône (espace des réactions)
Tout r admissible est combinaison à coefficients
positifs des rayons extrêmes
rayons extrêmes base convexe
Problème le cône nest pas toujours
pointé (réactions réversibles)
espace linéaire
Pour avoir une définition canonique 2 voies
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MPA Extreme Pathways
Par reconfiguration du réseau
Lidée classique pour toute variable libre x, on
pose x x - x- x gt0 x- gt0
Toute réaction réversible est partagée en 2
forward et backward
Rf
R

A
A
B
B
Rb
et
cône pointé
Extreme pathways extreme rays
29
MPA Elementary Flux Modes
En se basant sur une propriété des rayons extrêmes
Tout rayon extrême satisfait un maximum de
contraintes avec égalité (maximum au sens de
linclusion) Dans le cas irréversible
Toujours satisfaites avec égalité
Un maximum avec égalité ? un minimum de
réactions utilisées
Cas général
Elementary Flux Mode une distribution de flux
minimal (pour linclusion) en terme de réactions
utilisées
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MPA 2 voies 1 voie
En fait, extreme pathways elementary flux modes

• Sauf
• bi-cycle futile (futile 2-cycle)

Rf
A
B
(extreme pathway)
A
B
Rb

• problèmes de convention a linterface (flux
  entrants et sortants) pour les extremes pathways
  certains pathways optimaux peuvent être omis

• utiliser les Elementary Flux Mode

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MPA exemple
R6 et R9 sont parfaitement corrélées
(Klamt, 03)
32
MPA applications et limitations

• Identification de  voie métabolique  Base
  qui engendre toute solution admissible
• Contient une base pour les solutions optimales
  aux problèmes linéaires
• Corrélations de réactions
• Définition des délétions létales minimales
  (minimal cut set)
• Flexibilité du réseau (par le nombre dEFMs)
• Limitation explosion combinatoire
• Métabolisme central dE.coli (109 réactions, 500
  000 EM)

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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• propositions

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Modèles intégrés? vue densemble
Quantités / temps
réseau
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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Balance Analysis
• proposition

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Regulatory Flux Balance Analysis
La régulation contraint le métabolisme

• Covert, Palsson  transcriptional regulation in
  constraints-based metabolic models  J. Bio.
  Chem. 2002
• Réseau génique modélise comme un réseau booléen,
  qui réagit a la présence ou absence de
  métabolites internes ou externes.
• A une condition fixee par le reseau genique,
  FBA est appliquee
• Amélioration de la prédiction de viabilité de
  simples mutants
• (de 97 a 106 sur 116 )
• Amélioration des modèles dynamiques

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Plan

• Analyses du métabolisme par contraintes
• État quasi-stationnaire
• Metabolic Flux Analysis
• Irréversibilité
• Flux Balance Analysis
• Metabolic Pathway Analysis
• Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et
  métaboliques?
• Vue densemble
• Regulatory Flux Blance Analysis
• proposition

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Proposition
Le métabolisme contraint la régulation

• Quels degrés de liberté reste-t-il au réseau
  génique étant donné le réseau métabolique?
• gène constitutivement exprime?
• logique du réseau?
• un exemple enzyme subset

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Enzyme subset
Ensemble de réactions qui opèrent a ratio de
flux fixe 2 a 2 a létat stationnaire.
Ou correlation plus distante

• Pour linstant détecté au sein du noyau de N
  comme lignes colinéaires
• utilise pour réduire les modèles
•  vraisemblablement coregules 

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Proposition

• A quel point peut-on prédire des opérons par
  contraintes structurelles issues du métabolisme?
• Des structures logiques plus complexes (OU)
  comme un iso-enzyme ?

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Références (points dentrée)
Metabolic Flux Analysis Klamt et al.
2002 Calculability analysis in underdetermined
metabolic networks illustrated by a model of the
central metabolism in purple nonsulfur
bacteria.  Biotechnol Bioeng. Mar
3077(7)734-51 Flux Balance Analysis Edwards
et al 2001  In silico predictions of E. coli
metabolic capabilities are consistent with
experimental data  Nature Biotech.
19125-130 Metabolic Pathway Analysis Klamt,
Stelling 2003  Two approaches for metabolic
pathway analysis?  Trends in Biotech. 21
(2)64-69