Presentacin de PowerPoint

1
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE FACULTAD
DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DOCTORADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS MENCIÓN DE GENÉTICA MOLECULAR Y
MICROBIOLOGÍA
Conversión de nucleótidos marcados en ácido
desoxiribonucleicoDescubrimiento y
caracterización de la DNA polimerasa
Jaime Tobar R.
2
DNA como principio Transformante
Hershey, A. y Chase, M. 1952
3
Estructura del DNA Reglas de Chargaff
AT CG 1 PurinasPirimidinas 1
Chargaff E. 1949
4
Estructura del DNA
Watson J. Y Crick F. 1953
5
Componentes Básicos
6
Replicación del DNA
Propuesta Replicación
Crick, F. 1955
7
Cómo ocurre este proceso?
8
Timidina-C14 en DNA células cultivo
Incorporación tiempo dependiente
Friedkin M. y cols., 1955a
9
Timidina-C14 en el DNA embriones
Friedkin M. y cols., 1955b
10
Arthur Kornberg
11
Hipótesis
Un proceso tan vital para la célula no puede ser
llevado a cabo sin la regulación, catálisis y
fidelidad de una Enzima
12
Trabajos en E. coli Sistema in vitro
Extracto celular
Sonicación
Streptomicina
Precipitado
Sobrenadante

• DNA
• Primer
• MgCl2
• 32P-TTP
• ATP

S
P
Kornberg A. y cols., 1955b
13
Determinación Actividad
Acido Perclórico
Mezcla
1 hora, 37ºC
Resuspender
Precipitado
Radiactividad
Secar
Filtro
Kornberg A. y cols., 1955b
14
Primeros Trabajos en E. coli
Kornberg A. y cols., 1956
15
Primeros Trabajos en E. coli
Kornberg A. y cols., 1956
16
Reacción Planteada
Kornberg A. y cols., 1956
17
Purificación de la Polimerasa en E. coli
1. Preparación de dNTPs
E. coli crecida en 32P-Ortofosfato
Extracción de DNA
DNasa pancreática
dTTP
dGTP
Polideoxiribonucleótidos
dATP
dCTP
Fosfodiesterasa
Mononucleótidos
Cromatografía
Kinasas Parcialmente Purificadas
ATP
Lehman I.. y cols., 1958
18
Purificación de la Polimerasa en E. coli
2. Preparación del DNA
E. coli crecida en 32P-Ortofosfato
Infección Fago T2
Placas de Lisis
Aislar Fago Romperlo
DNA
Lehman I.. y cols., 1958
19
Purificación de la Polimerasa en E. coli
3. Preparación de la enzima
Lehman I.. y cols., 1958
20
Caracterización de la Polimerasa
1. Requerimientos para la actividad
Bessman M. y cols., 1958
21
Caracterización de la Polimerasa
1. Requerimientos Reacción Limitada
Bessman M. y cols., 1958
22
Caracterización de la Polimerasa
3. Tipo de Producto Liberación Pirofosfato
Bessman M. y cols., 1958
23
Caracterización de la Polimerasa
3. Tipo de Producto Uso de Análogos
Adler J. y cols., 1958
24
Conclusiones

• Se dispone de actividad enzimática purificada
• DNA sirve como Primer o Templado
• Sucede sólo si hay complementación
• Características químicas de la reacción como del
  producto concuerdan con modelo propuesto

Por Realizar

• Prueba función directa DNA con enzima
• Mejor definición de la naturaleza de la enzima
• Actividad biológica DNA sintetizado

25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
Hallazgos Posteriores
28
Síntesis sin templado aparente1
Estudios cinéticos posteriores lo confirmaron2
1. Schachman H. y cols., 1960 2. Radding C. y
cols., 1962
29
Validación de las Hipótesis
Vecino mas cercano (Nearest neighbour)
Estimación dinucleótidos
42 16
Josse y cols., 1961
30
Validación de las Hipótesis
Vecino mas cercano (Nearest neighbour)
Josse y cols., 1961
31
Validación de las Hipótesis
Vecino mas cercano (Nearest neighbour)

• Existen las 16 formas de dinucleótidos posibles
• Patrón único y reproducible
• Reacción involucra A/T y G/C
• La doble hélice está arreglada en direcciones
  opuestas

Josse y cols., 1961
32
Síntesis de DNA genéticamente activo
Goulian M. y cols., 1967
33
Nucleasa en la Polimerasa
Kelly R. y cols., 1969
34
La Polimerasa Bajo Juicio
De Lucia P. y Cairns J., 1969
35
La Polimerasa Bajo Juicio
Kornberg T. y Gefter M., 1970
36
(No Transcript)
37
Proyecciones asociadas al descubrimiento

• Caracterización de las tres enzimas en sentido
  fisiológico
• Otras enzimas presentes en E. coli Pol IV y Pol
  V
• Búsqueda de enzimas homólogas en otros sistemas
• Ingeniería Genética
• Que fue de Arthur Kornberg?

38
Arthur Kornberg
39
(No Transcript)