Diapositiva 1

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Marcación de proteínas con radioisótopos
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FUNDAMENTO Interacción Ag - Ac
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• VENTAJAS
• Alta AE
• Simplicidad incorporación en residuos de Hys ó
  Tyr
• Emisor ? puro. Los contadores tienen alta
  eficiencia para el 125I
• Suele proveerse con eficiencia cercana al 100
• DESVENTAJAS
• Potencial riesgo para la salud

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• Para la marcación exogena es necesario tener en
  cuenta
• Residuo a marcar expuesto Tyr/His dependiendo
• del pH
• No distorsión de epitopes
• Sensibilidad de la proteína a la oxidación (-SH)
• Cantidad de proteína gt 1?g

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Marcación exógena con 125I
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• SUBVARIANTES DE LOS MÉTODOS DE MARCACIÓN
• Iodo estequiométrico, Oxidante limitante
• Iodo subestequiométrico, Oxidante limitante
• Iodo subestequiométrico, Oxidante en exceso

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Tipos de síntesis metabólicas - Síntesis
química de péptidos / proteínas - Síntesis
endógena - Síntesis recombinante ? bacterias ?
levaduras ? células eucariotas in vitro ?
lisado de reticulocitos de conejo
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USOS DE LA PROTEINA MARCADA EN INMUNOQUIMICA RIA
- detección de antígenos - determinación de
PIP de anticuerpos RBA - detección de
anticuerpos y autoanticuerpos
específicos. Inmunoprecipitación - detección
de anticuerpos y autoanticuerpos
específicos. - estudio de antígenos
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Inmunoprecipitación
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Concepto Identificación de un antígeno a partir
de una mezcla compleja mediante el uso de
anticuerpos específicos
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ESQUEMA GENERAL
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• PASOS
• Marcación del antígeno (opcional)
• Lisis de las células para liberar el antígeno
• Formación de inmunocomplejos
• Aislamiento y lavado de los inmunocomplejos
  formados
• Detección
• Consideraciones
• Abundancia del antígeno
• Afinidad del anticuerpo

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Protocolo de Inmunoprecipitación

• Marcación radiactiva del antígeno
• Marcación metabólica
• Marcación exógena
• Lisis de las células
• Células sin pared
• - Detergentes
• - Congelamiento y descongelamiento
• - Agentes desnaturalizantes (SDS y calor, Urea
  8M)
• - Métodos físicos (ruptura mecánica,
  ultrasonido)
• Células con pared (levaduras, bacterias)
• - Métodos físicos
• - Tratamiento con enzimas ?detergentes

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• BUFFERS DE LISIS
• El antígeno debe ser liberado eficientemente y
  aun ser reconocido por el anticuerpo
• Composición
• Detergentes Preferentemente no iónicos
• - no iónicos 0.1 - 2
• - iónicos 0.01 - 0.5
• Sales lt 1M
• Cationes divalentes lt 10mM
• EDTA lt 5mM
• pH 6 - 9
• Inhibidores de proteasas Aprotinina, EDTA,
  PMSF, etc.
• DNasa

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• EJEMPLOS
• NP-40 Lysis
• 150 mM NaCl, 1.0 NP-40, 50 mM Tris (pH 8.0)
• High Salt Lysis
• 500 mM NaCl, 1.0 NP-40, 50 mM Tris (pH 8.0)
• Low Salt Lysis
• 1.0 NP-40, 50 mM Tris (pH 8.0)
• RIPA
• 150 mM NaCl, 1.0 NP-40, 0.5 DOC, 0.1 SDS,
  50 mM Tris (pH 8.0)

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3. Formación de inmunocomplejos Variables a
tener en cuenta

• Cantidad de anticuerpo a agregar
• Volumen final
• Uso o no de un segundo anticuerpo

• a) ACS. POLICLONALES
• Complejos más estables
• Mayor unión inespecífica Cómo se puede
  disminuir?
• - Adsorber con sueros
• - Lavados más drásticos
• - Purificar Ag

• b) ACS. MONOCLONALES
• Mayor especificidad y menor unión inespecífica
• Depende de la afinidad (cuidado con los lavados)
• Afinidad variable por la proteína A (RAM)

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ELECCIÓN DEL ANTICUERPO
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• Aislamiento y lavado de los inmunocomplejos
• Proteína A/G
• Segundo anticuerpo
• PEG o PEG segundo anticuerpo (Ag puro)
• Detección
• Contador de centelleo líquido o sólido (Ag puro)
• Autorradiografía / Fluorografía
• Western blotting

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Cómo disminuir el inespecífico?

• Preclarificar el lisado antes de agregar el
  anticuerpo específico (100000 g 30 min.)
• Agregar cantidades saturantes de proteínas
  competidoras (BSA, gelatina, leche en polvo, SAC,
  proteína A Sepharose)
• Centrifugar el lisado (100000 g 30 min.)
• Centrifugar el anticuerpo (100000 g 30 min.) y
  titular
• Usar lavados más astringentes (1M NaCl, 0.2 SDS,
  1 Tween 20)
• Aumentar el número de lavados
• Disminuir las cpm agregadas del Ag
• No congelar los lisados antes de usarse
• Centrifugar el complejo Ag-Ac a 10000 g 10
  minutos inmediatamente antes de agregar el
  inmunosorbente

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• USOS
• Determinar la presencia y cantidad de un
  antígeno
• Peso molecular relativo de una cadena
  polipeptídica
• Velocidad de síntesis o degradación
• Presencia de modificaciones post-traduccionales
• Interacciones con proteínas, ácidos nucleicos u
  otros ligandos
• Detección de autoanticuerpos

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Ejercicios
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1) El Sindrome de Stiff-Man es un desorden
neurológico raro, caracterizado por la presencia
de autoanticuerpos en el suero de los pacientes.
Estos autoanticuerpos están dirigidos contra una
proteína expresada en cerebro. Dicha proteína
humana es altamente homóloga a la proteína de
rata la cual se expresa en cerebro y páncreas. Se
quiere diseñar un ensayo de inmunoprecipitación
para la detección de estos autoanticuerpos en el
suero de los pacientes. A partir de estos datos
indique cuál es la opción correcta, justificando
en todos los casos.

• A)    Islotes pancreáticos de rata marcados
  metabólicamente
• -         Obtención de la fracción citosólica (en
  la que se encuentra la proteína de interés)
• -         IP con los sueros de pacientes
• -         Separación con proteína A sepharose
• - Detección a través de centelleo líquido

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• B)    - Proteína extractiva obtenida a partir
  de cerebro de rata
• -         Purificación de la proteína por
  afinidad
• -         Marcación exógena con 125I
• -         Purificación para eliminar el 125I
  libre
• -         IP empleando el suero de los pacientes
• -         Separación de los inmunocomplejos con
  proteína A sepharose
• -         Detección a través de centelleo sólido
• C)    - Expresión de la proteína recombinante
  en células CHO
• -         Marcación exógena con 125I
• -         Purificación para eliminar el 125I
  libre
• -         IP empleando el suero de los pacientes
• -         Separación de los inmunocomplejos con
  proteína A sepharose
• - Detección a través de centelleo sólido

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2) La proteína tirosina fosfatasa IA-2 es un
autoantígeno de 45 kDa involucrado en la Diabetes
Mellitus Autoinmune, generando en las personas
con dicha enfermedad autoanticuerpos específicos.
Esta proteína se clonó en un vector de expresión
con el que se transfectaron células CHO. A partir
de las mismas se siguieron dos estrategias de
trabajo para la detección de los auotanticuerpos
Sueros de pacientes SHN
MWM LT
MWM LT
IA-2
lisis
transferencia
quimio
SDS-PAGE
35S-Met
lisis
MWM SHN Pac
MWM SHN Pac
SDS-PAGE
fluorografía
Sueros de pacientes Prot A-Seph
Interprete los resultados obtenidos en cada caso.
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