Presentacin de PowerPoint

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TIPOS DE DIABETES
DIABETES GESTACIONAL
TIPO 1
TIPO 2
4 de las embarazadas
10
90
2
DIABETES EN EL MUNDO
HOY 170 MILLONES
2010 230 MILLONES
3
PREVALENCIA EN
ARGENTINA
1990 2003
6 al 7 de la población 8 al 9 de la población
4
Breve historia de la insulina

• S 1 Aratacus, Capadocia Diabetes.
• S 4 India, hormigas en orina de diabéticos.
• S 17 Thomas Willis, Oxford, orina dulce.
• S 19 Claude Bernard el hígado secreta una
  sustancia azucarada que causa la diabetes.
• 1869 Paul Langerhans describe 2 sistemas de
  células en el páncreas.
• 1879 J. Von Mering Extracción de páncreas de
  perros diabetes. Intento de aislar sustancia
  antidiabetogénica del páncreas.
• 1910 Sharpey-Shafer los diabéticos carecen de
  una sustancia química del páncreas INSULINA.

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• 1921 F. Banting, Canadá. En el lab.de
  J.J.Macleod, con Ch. Best y J. Collip con
  extracto de páncreas de perro recuperan a un
  perro diabético.
• 1922 L. Thompson es tratado con éxito con el
  extracto de páncreas. Premio Nobel para Banting y
  Macleod.
• 1923 La Universidad de Toronto da a las
  compañías farmacéuticas la licencia para producir
  insulina libre de regalías.
• 1923 Ely Lilly produce insulina.

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• 1926 J. Abel cristaliza insulina
• 1955 F. Sanger secuencia a la insulina. Premio
  Nobel.
• 1963 Katsoyannis Insulina, 1er proteína de
  síntesis química.
• 1972 Se conoce la estructura de insulina por
  crist. de rayos x. P.Nobel para Dorothy Hodgin.
• 1978 Investigadores de City of Hope National
  Medical Center y Genentech producen insulina
  recombinante.
• 1979 Insulina es la 1er proteína que se produce
  y comercializa hecha con técnicas de ADN
  recombinante.

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(No Transcript)
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ESTRUCTURA SECUNDARIA DE INSULINA
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ESTRUCTURA TERCIARIA DE INSULINA
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ESTRUCTURA CUATERNARIA DE INSULINA
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(No Transcript)
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Biosíntesis de IH
Carboxipeptidasa
I.P.
Des B30 Ins.
-H2O -Ala
Tripsina
Tripsina
-H2O
-Ala
Des B30 Ins.-Tripsina
Transpeptidación
Acople
Tre-OR
I.H.-OR
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Insulina Recombinante Estado Actual

• La mayor parte de las insulinas humanas que se
  comercializan actualmente son producidas en
  bacterias o levaduras genéticamente modificadas.
• Este producto ha reemplazado a la mayor parte de
  las insulinas obtenidas a partir de páncreas
  bovinos y porcinos.

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Características Importantes a tener en Cuenta en
la Producción de Proteínas Recombinantes
. Complejidad de la Molécula estructura
secundaria y terciaria
glicosilación . Uso investigación d
iagnóstico terapéutico cantidad de producto .
Propiedad Intelectual
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Elección del sistema de expresión
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Estrategia de producción
Síntesis de las cadenas separadas
Producción de un Precursor
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Características del uso de bacterias en la
producción de IH

• Son atractivas por la simplicidad del sistema
• Hay una gran variedad de promotores
• El crecimiento es muy sencillo y hay medios de
  cultivo definidos
• Son convenientes para el crecimiento en grandes
  fermentadores
• Producen altos rendimientos
• La producción es en forma de cuerpos de inclusión
• No producen modificaciones pos-traduccionales ni
  puentes disulfuro

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N-met- cadena A
N-met- cadena B
Clivaje con CNBR
Cadena B
Cadena A
Sulfitólisis oxidativa
A (SSO3)4-
B (SSO3)4-
Purificación
Combinación
Insulina cruda
C.I.I. , Exclusión molecular y RP-HPLC
Insulina Pura
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Caracteristícas del uso de levaduras en la
producción de IH

• Convenientes para el crecimiento en grandes
  fermentadores
• Buenos rendimientos (inferiores a los de E .coli)
• Introducen modificaciones postraduccionales
• Estabilidad genética del gen heterólogo
• Proteólisis

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Precursor recombinante
Precursor purificado parcialmente
Purificación cromatográfica
Clivaje proteolítico
Insulina cruda
C.I.I.
Cristalización
RP-HPLC
Exclusión molecular
Insulina Pura
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Levaduras
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OBTENCIÓN DEL GEN

• Mediante RT-PCR a partir del RNAm utilizando
  primers específicos.
• Síntesis de genes por PCR

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Construcción del gen para expresar en levaduras

• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes
  en la región 5no codificante (5UTR) ya que
  secuencias ricas en G y estructuras 2as son
  inhibitorias de la iniciación de la traducción
• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en
  AT, preferentemente AAAAAATG ya que esto favorece
  la iniciación de la traducción
• 3- Uso de codones propios del sistema
• 4- Usar ADNc
• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios
  de poliadenilación, estructuras 2as cerca del
  ATG, sitios de glicosilación, etc.
• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado

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Pichia pastoris
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LEVADURAS METILOTRÓFICAS

• Son capaces de utilizar metanol como única fuente
  de C
• Poseen capacidad de crecer a altas densidades,
  proceso fácilmente escalable a grandes volúmenes
  de producción
• La producción de proteínas heterólogas en cepas
  transformadas con promotores fuertemente
  inducibles pueden alcanzar rendimientos de hasta
  el 30 - 40 de las proteínas solubles celulares.
• Este sistema de expresión de proteínas
  heterólogas se ha convertido en uno de los más
  difundidos tanto en investigación básica como
  así también en procesos industriales

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ALCOHOL OXIDASA

• AOX esta constituída por un octámero de
  subunidades idénticas a las que se le unen
  moléculas de FAD.
• Son las primeras enzimas del camino metabólico de
  metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y
  AOX2.
• AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La
  células compensan esta baja actividad catalítica
  sintetizando grandes cantidades de la enzima.
  Cuando las levaduras metilotróficas crecen en
  glucosa, AOX no es detectable, mientras que en
  metanol llega a representar el 30-35 de las
  proteínas celulares solubles.
• La síntesis de AOX es regulada a nivel
  transcripcional.
• A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97 de
  homología.

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(No Transcript)
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Vectores de expresión para Pichia pastoris
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MF?1
Proteína de 165 aa prepro ? factor Procesamiento
clivaje del péptido señal corte
de Lys-Arg por KEX2 remoción de
pares Glu-Ala por diaminopeptidasa STE1
remoción de Lys-Arg terminal por KEX1
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Integración cromosómica de ADN por recombinación
homóloga
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Inserción génica en AOX
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Inserción génica en his4
33
Inserciones múltiples
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Reemplazo génico
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Selección de cepas recombinantes HisMut e
HisMuts
Mut
Muts
Muts
Medio MM
Medio MD
36
CRISTALES DE INSULINA
37
(No Transcript)
38
Aplicación de insulina
39
 
Nature Biotechnology  22, 1195 - 1196 (2004)
doi10.1038/nbt1004-1195 Inhaled insulin
products puff along Kendall Powell
40
Nature Biotechnology  22, 1115 - 1124 (2004)
Clonal identification of multipotent precursors
from adult mouse pancreas that generate neural
and pancreatic lineagesRaewyn M Seaberg1, 6,
Simon R Smukler1, 6, Timothy J Kieffer2, Grigori
Enikolopov3, Zeenat Asghar4, Michael B Wheeler4,
Gregory Korbutt5  Derek van der Kooy1