Presentacin de PowerPoint

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METODOS DE PREPARACION DE MUESTRAS Dra.
Laura García Facultad de Ciencias
Universidad de la República
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TIPOS DE MUESTRAS   Sangre entera (EDTA)
Plasma (EDTA) o suero generalmente en
virología Células aisladas (Mononucleares, en
cultivo) Tejidos (Congelar en nítrógeno líquido
lo más rápido posible para evitar la degradación
del RNA o DNA) Líquidos biológicos Orina o
exudado cervical (Chlamydia trachomatis o
Neisseria gonorrhorae) Líquido amniótico para
diagnóstico prenatal LCR Líquido pleural
para el diagnóstico de metástasis cancerosas o
enfermedades linfoproliferativas   Muestras de
la pared bucal para obtener muestras de
DNA Médula ósea para dg de enf.
Linfoproliferativas o la detección de metástasis
cancerosas. Esputo para la detección de
Mycobacterium tuberculosis Pus estudio de
bacterias Tejidos parafinados o fijados. Muestras
de sangre en papel Guthrie
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CONSERVACION DE LAS MUESTRAS Sangre
entera Tejidos procesar rápidamente , si no se
puede lo mejor es sumergirlo 15-20s seg en
nitrógeno líquido y después conservar a 70ºC
hasta la extracción de DNA. Si no tengo 70, lo
corto en pedacitos pequeños para asegurarme una
rápida congelación Plasma o suero congelar a
70 o 20 en alícuotas Orina estable para C.
trachomatis y N. gonorreae por 4 días a 4ºC y 60
días si se congela Exudado cervical - en medio
de transporte se conserva igual que orina.
Preguntar al fabricante porque varía el tiempo
que resiste cada uno. Bucal en general estable
a RT, pero es conveniente realizar la extracción
lo antes posible por las bacterias
contaminantes Líquido amniótico. Se procesa
enseguida.Si no es posible congelar el pellet
celular y remover previamnete los GR Médula
ósea y líquido pleural. No debe congelarse (x
hemo) se puede refrigerar a 4ºC por menos de 72
horas pero lo ideal es procesarla
enseguida Esputo guardar a 2-8 ºC hasta ser
procesada pero debe hacerse dentro de las 24
horas de la recolección (decontaminación y
concentración) . Pus, se puede refrigerar o
congelar si no tiene GR Tejido fijado . Especímen
de último recurso.
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• METODOS DE EXTRACCION DE RNA
• Extracción con Tiocianato de guanidinio-Fenol-Clo
  roformo
• Trizol
• Columnas de Sílica Gel (RNeasy Mini kit -Qiagen)
• Purificación por afinidad, con oligo-dT (para
  mRNA)
• - Equipos automatizados
• Los métodos de columnas son métodos rápidos y
  seguros al no utilizar extracciones fenólicas.
• Los métodos fenólicos son mejores para procesar
  volúmenes mayores de muestra (grs.) y obtener
  mejores rendimientos.

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METODOS DE EXTRACCION DE RNA
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QUE METODO ELIJO? ITG Trizol
Sílica Tengo muchas muestras
X Tengo un gran volumen de una muestra
X X Que me dé poco trabajo

X Sin DNA genómico por
favor! X Tejidos con lípidos
abundantes
X Sin fenol! X Sin
alcohol!
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CONSERVACION DE LAS MUESTRAS DE RNA lábiles Se
deben congelar y trabajar en frío Se conserva
bien en alícuotas a 70ºC. Se pueden usar
inhibidores de RNAsas El RNA purificado se guarda
mejor precipitado en OL en 70ºC. El RNA
ribosomal puede ser estable por días o meses a
temperatura ambiente cuando se guarda en
soluciones caotrópicas como isotiocianato de
guanidina.
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METODOS DE EXTRACCION DE DNA
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CONSERVACION DE LAS MUESTRAS DE DNA El DNA
purificado es relativamente estable si se
encuentra en un buffer libre de DNAsas. Se ha
visto que es estable a 4ºC por 3 años. Los
ciclos de congelado-descongelado dañan el DNA por
lo cual se recomienda alicuotar las
muestras. Tips de punta estrecha pueden cortar
hebras de DNA cuando se trabaja en solución.
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EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE PIEZAS
PARAFINADAS. Se utilizan 2-3 cortes
histológicos de 6 u de espesor para un tubo
eppendorf de 1.5 ml. Previo al procedimiento
antes mencionado, estas muestras necesitan ser
desparafinadas con xileno y etanol rehidratadas
en buffer TE Luego es necesario separar los
ácidos nucleicos de las proteínas a las cuales se
encuentran unidas por cross-linking mediante
tratamiento con Proteasa K. Si este paso no se
realiza, las proteínas unidas a los ácidos
nucleicos los arrastrarán a la interfase en la
extracción por fenol. El procedimiento provoca
la ruptura del DNA por lo cual puede no haber
amplificación si el producto de PCR buscado es
muy largo (gt de 1000 bp) o para ligación. Si no
me interesa este punto puedo calentar a 95ºC para
desnaturalizar el DNA y obtener mayor rendimiento
en la extracción.