Prezentace aplikace PowerPoint

1
DC bunky a Toll-like receptory propojují systém
prirozené a specifické imunity
Radek píek, Ústav imunologie, UK, 2. LF
2

• Dendritické bunky
• Toll-like receptory
• Toll-like receptory v klinické imunologii
• DC v imunoterapii

3
Role imunitního systému

• detekce prítomnosti infekcního agens
• eliminace patogenu bez naruení vlastních tkání
• Nástroje systémy prirozené a specifické imunity

4
Specifická imunita

• náhodný a vysoce diverzifikovaný repertoár
  antigenních receptoru (TCR, BCR)
• klonální selekce a expanze bunek, které
  exprimují receptor specifický pro urcitý antigen

ALE!!

• klonální expanze trvá dlouho

• primární imunitní odpoved se vyvíjí 4-7 dnu

• primární imunitní odpoved nemue být zahájena
  bez signálu,
• který je poskytnut systémem prirozené imunity

5
Cross-talk between innate and adaptive immunity
6
Funkcní vlastnosti in vitro GC oetrených DC
Indukce proliferace lymfocytu ve smesné
lymocytární reakci
DC
kontrola
DC
Dex pri diferenciaci
Dex pri maturaci
Pomer 110, 5 dní
7
ELISPOT
Detekce jednotlivých T lymfocytu sekretujících
urcitý cytokin
8
ELISPOT
Detekce jednotlivých T lymfocytu sekretujících
urcitý cytokin
9
Charakterizace aktivovaných CD8 T lymfocytu
10
Cyklus DC
R. Steinman, 1999
11
Príprava DC

12
Fenotyp DC
CD14
CD40
CD36
HLA-DR
HLA-ABC
CCR7
CD80
CD83
CD86
13
Phenotype of DC treated 48 hours
Immature DC
Mature DC
CD14
CD40
CD36
CD14
CD36
CD40
Poly (IC)
HLA-DR
HLA-ABC
CCR7
HLA-DR
HLA-ABC
CCR7
CD80
CD83
CD86
CD86
CD80
CD83
14
Chemotaxe v odpovedi na MIP3 beta

• Zralé DC exprimují CCR7, který je ligandem pro
  MIP3 beta a umonuje
• migraci zrajících DC do lymfatických uzlin
• Ve horní jamce insertu je konstantní mnoství
  DC, ve spodní jamce
• testovaný chemokin (zde MIP 3beta).

15
Role of the immune system
Immature DC
Poly (IC)
LPS
CD80
CD86
CD83
CD40
HLA-DR
HLA-ABC
CD11c
16
Aktivace DC bakteriálními imunomodulátory
CD80
Spisek, Vaccine, 2004
17
Role HSP v indukci CTL
18
Látky schopné aktivovat DC

• Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)-
  LPS, peptidoglykan, lipoteiochová kyselina,
  flagelin, dsRNA, bakteriální DNA
• Prozánetlivé cytokiny- TNF, IL-1b, IL-6, IFN
  gamma
• Fc fragmenty protilátek
• Signály exprimované aktivovanými T bunkami- IFN
  gama, CD40L, TRANCE
• Produkty uvolnené z nekrotických bunek- HSP

19
Interakce T lymfocytu a DC v lymfatických orgánech
20
Interakce mezi DC a T lymfocyty
21
Kinetics of phenotypic DC maturation during 48 h
continuous treatment by TNFaPoly(IC).
CD80
CD83
CD86
DC-LAMP
CD40
CD36
MFI
HLA-DR
HLA-ABC
CCR7
hours
22
Kinetics of cytokine production during 48 h
continuous treatment by TNFaPoly(IC).
23
Kinetics of production of IL-10 and p70 IL-12
during DC maturation for 48 h
IL-10
IL-12 p70
mRNA IL-12 p70
Concentrations of cytokines present in the
culture supernatants were determined at different
timepoints by ELISA. Analysis of p35 and p40
IL-12 mRNA expression by RT-PCR
24
48 h phenotype of DC initially stimulated for
indicated periods of time
CD83
CD86
CD80
DC-LAMP
CD40
HLA-ABC
HLA-DR
Phenotypic DC maturation by TNFaPoly(IC) is an
irreversible phenomenon proceeding independently
of further presence of maturating stimuli
25
Effect of the restimulation by CD40LIFNg on the
phenotypic properties of DC initially matured by
TNFaPoly (IC) for different periods of time
Phenotype at 48 h after TNFaPoly (IC)
stimulation
Phenotype 24 h after restimulation with
CD40LIFNg
time of initial TNFaPoly (IC) treatment
DC exposed to TNFaPoly (IC) for 2 h to 8 h
preserved their capacity to further upregulate
the expression of their costimulatory and
maturation-associated markers upon restimulation
by T-cell derived stimuli
26
Amounts of IL-12 p70 in 48 h culture supernatants
CD40LIFNg restimulation
TNFaPoly (IC) stimulation
pg/ml
pg/ml
time of initial TNFaPoly (IC) treatment
27
Th1/Th2 polarizace
Lymfocyty stimulované zralými DC
Nestimulované lymfocyty
TNFaPoly (IC)
IL-4
IFN gamma
28
T-cell stimulatory capacities of Poly (IC)
stimulated DC



cpm
Immature KLH-pulsed DC were exposed to TNFaPoly
(IC) for indicated periods of time, TNFaPoly
(IC) was then removed, and all DC preparations
were used as stimulators of autologous
lymphocytes 48 h after the initial activation.
29
Vliv aktivacního stavu DC na aktivaci T lymfocytu
DC aktivované 8 hod
DC aktivované 48 hod
30
Summary-1

• Transient stimulation of DC by an activation
  signal starts an irreversible program of
  phenotypic maturation
• Transiently stimulated (lt 8 h) DC secrete lower
  amounts of bioactive IL-12 during the 48 h period
  of first stimulation than cells activated
  continuously for 48 h
• DC stimulated for a shorter periods of time
  preserve higher sensitivity to boosting upon
  subsequent stimulation by T-cell derived signals
  at the level of phenotype and IL-12 secretion
• DC initially stimulated for shorter periods of
  time are more potent stimulators of T lymphocytes

31
Mature vs Immature DC in vitro
CD4 T lymphocytes PHA
CD4 T lymphocytes iDC
CD4 T lymphocytes mDC
CFSE
Rozkova, 2004
32
Mature DC-T cell responses
Allogeneic MLR

• Ability to stimulate allogeneic T cells
  corresponds with expression of CD83 molecule
• Combination of proiflammatory cytokines and
  TNF?Poly IC most efficient in all DCT ratios

TNFaIL-1bIL-6PGE2
60000
TNFaPoly ICsCD40L
50000
TNFaIL-1bIL-6PGE2sCD40L
40000
TNFaPoly IC
Poly IC
30000
TNF a
20000
sCD40L
PGE2
10000
immature DC
0
Proliferation of KLH-specific T cells
110
120
140
lymphocytes

• DC were pulsed with KLH (25 ?g/ml) and matured
  by TNF?Poly IC
• Proliferation of KLH-specific autologous T cells
  was measured after 7 days
• Only KLH-pulsed mature DC elicited KLH-specific
  proliferation

DC immature
DC imm.KLH
cpm
DC TNFPoly IC
DC TNFPoly ICKLH
lymphos
lymphosKLH
110
120
33
Nezralé DC in vivo

• Sníení frekvence antigen specifických T
  lymfocytu po podání nezralých DC

34
Zralé DC in vivo

• Indukce Ag- specifických T lymfocytu po injekci
  zralých DC

35
Ovlivnení autoimuního onemocnení iDC

• Zabránení vzniku EAA injekcí nezralých DC
  pulzovaných MBP

36
Fenotyp DC in vitro ovlivnených GC
Exprese CD80
100
80
60
pozitivních bunek
40
20
0
Exprese CD83
DC
dex 10-6
dex 10-6
pred 10-6
pred 10-6
metylpred 10-6
metylpred 10-6
100
80
60
pozitivních bunek
40
20
0
DC
dex 10-6
dex 10-6
pred 10-6
pred 10-6
metylpred 10-6
metylpred 10-6
Exprese CD86
800
600
fluorescence
400
200
0
DC
dex 10-6
dex 10-6
pred 10-6
pred 10-6
metylpred 10-6
metylpred 10-6
37
Látky schopné aktivovat DC

• Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)-
  LPS, peptidoglykan, lipoteiochová kyselina,
  flagelin, dsRNA, bakteriální DNA
• Prozánetlivé cytokiny- TNF, IL-1b, IL-6, IFN
  gamma
• Fc fragmenty protilátek
• Signály exprimované aktivovanými T bunkami- IFN
  gama, CD40L, TRANCE
• Produkty uvolnené z nekrotických bunek- HSP

38
Vliv stadia DC na vznik imunitní reakce
39
Systém prirozené imunity

• detekce konstitutivních a konzervovaných
  produktu mikrobiálního metabolismu
• Charakteristiky
• produkovány pouze mikroby
• nemenné mezi mikroby urcité skupiny
• nezbytné pro preití mikroba

40
Pattern Recognition Receptors (PRRs)
41
Systém prirozené imunity

• PAMP jsou rozeznány pomocí Pattern Recognition
  Receptors (PRRs)

Sekretované PRRs MBL, LBP, proteiny akutní fáze
Povrchové PRRs CD14, TLRs, Manosový receptor
Intracelulární PRRs PKR, NODs, TLRs
Funkce Opsonizace, aktivace komplementu,
fagocytoza, aktivace prozánetlivých
signalizacních kaskád
42
Toll-like receptors

• family of type I transmembrane receptors
• extracellular leucine-rich domain
• intracellular Toll/IL-1 receptor (TIR) domain

43
(No Transcript)
44
Toll-like receptory

• Transmembránové receptory I. typu
• extracelulární doména bohatá na leucin
• intracelulární Toll/IL-1 receptor (TIR) doména

45
(No Transcript)
46
Podtypy DC a exprese TLR
47
NF?B signalizace

• TLR
• NOD receptory
• IL-1, 15, 17 a TNF receptor
• TCR, BCR
• ectodysplazin
• RANK

48
Interakce T lymfocytu a DC
49
Deficit IRAK-4
Picard, Science, 2003
50
Deficit IRAK-4

• ivot ohroující infekce v detství (S.
  pneumoniae, S.aureus)
• klinické projevy se zlepují s vekem
• nízká odpoved bunek periferní krve na stimulaci
  IL-1 a ligandy TLR

51
Mutace NEMO

• X-vázaná anhidrotická ektodermální dysplazie s
  imunodeficitem- X-EDA-ID
• hypo-, adoncie, absence potních láz, absence
  vlasu, obocí, opakované teké bakteriální infekce
  (G, G-, mykobakteria)
• EDA- následek defektní aktivace NF?B po
  stimulaci ectodysplazinem

52
Mutace I?B?

• opakované, ivot ohroující infekce,
  neprospívání- BMT v 8 mesících veku
• Kompletní blok signalizace pres NF?B
• Pouze naivní T lymfocyty, ádné postvakcinacní
  protilátky

53
Shrnutí-2

• Specifická odpoved je sputena signálem systému
  prirozené imunity
• Patogeny jsou rozpoznávány interakcemi PAMP-PRR
• TLR dodávají nezralým DC aktivacní signál
• Nezralé a zralé DC mají zcela odliné schopnosti
  stimulovat T lymfocyty
• Pouze zralé DC aktivují naivní T lymfocyty
• detailní poznání signalizacní drah vede k
  identifikaci
• nových primárních imunodeficitu

54
TLR-9 a pametové B lymfocyty

• Exprese TLR-9 se zvyuje po aktivaci naivních B
  lymfocytu
• Stimulace TLR-9 CpG pri infekcích udruje pool
  pametových B l.

55
(No Transcript)
56
(No Transcript)
57
Zdroje nádorových antigenu
R. Steinman, 1999
58
Schéma protokolu
Leukaferéza
Gregoire, Vaccine, 2003
59
Provedené klinické studie

• Metastazující melanom nádorové antigeny 3
  peptidy (HLA-A2) nebo 2 peptidy (HLA-A1) nebo
  autologní lyzát, DC nezralé, i.n. 16/16 proti KLH
  11/16 proti peptidum, 2 CR, 3 PR, 1 MR, 10 PD
  (Nestle et al., 1998)
• Metastazující melanom nádorové antigeny 1
  peptid Mage-3 (HLA-A1), DC zralé, pomocí MCM /-
  TNF s.c. i.d., poté i.v., 11/11 proti TT nebo
  tuberkulinu 8/11 proti peptidu 6 PR / MR 5 PD
  (Thurner et al., 1999)
• Metastazující karcinom ledvin Fúze DC a
  autologních nádorových bunek, DC zralé pomocí TNF
  s.c. i.n.  
• 11/17 proti autolognímu lyzátu 4 CR, 2 PR, 1 MR,
  2 S, 4 PD, 4 D (Kugler et al., 2000)

60
DC v imunoterapii nádoru na 2.LF UK

• Detská akutní lymfoblastická leukémie
• Karcinom ovária
• Karcinom prostaty
• charakteristika DC pripravených po chemoterapii
• príprava nádorových antigenu
• optimalizace stimulace T lymfocytu
• príprava a schvalování klinických protokolu

61
Rationale

• Acute myeloid leukemia monoclonal proliferation
  of undifferentiated myeloid progenitors
• gt 80 of patients achieve complete remission x
  15 overall survival at 5 years
• All patients have minimal residual disease
  following induction therapy
• Limited number of described tumor Ag (products
  of chromosomal translocations, proteinase 3, WT1,
  MUC-1 ?)
• ? use of whole tumor preparations for DC pulsing
  could possibly overcome these constraints

62
Patients characteristics

• Gender female n4 male n6
• Age median 65 years (29-71 years)
• FAB subtypes of de novo AML M0 n1
• M1 n4
• M4 n1
• M5 n3
• Biphenotypic n1
• Associated chromosomal abnormalities
• MLL amplification n1
• MLL deletion n1
• Induction chemotherapy Ara-C, Idarubicin n10

63
Study design
64
Generation of DC
DC of non-leukemic origin
Leukemic DC
Monocytes (remission blood samples)
AML blasts (gt70 in bone marrow or blood samples)
Day 0
GM-CSF (500 U/ml) IL-4 (15 ng/ml)
GM-CSF (500 U/ml) IL-4 (15 ng/ml) TNFa (10
ng/ml)
immature DC
Day 5
Ag-pulsing
Day 6
TNFa (10 ng/ml) Poly(IC) (25 mg/ml)
Maturation
mature DC
leukemic DC neg. CD14, MHC II. , CD80, CD86,
CD83
Day 7
65
DC phagocytose apoptotic leukemic blasts
DC IL-4
Apoptotic cells

DC IL-4CAEDTA
DC IL-4CA 11

64
PKH-26-red fluorescence
35

DC IL-4CAEDTA
DC IL-4CA 13
97

• All apoptotic cells cleared within 24 hours
• Ratio 3 tu cells for 1 DC necessary to pulse all
  DC in culture

2
HLA-DR-FITC
66
Leukemic DC
Leukemic origin of DC MLL gene amplification
(Patient 10) (FISH analysis)
Phenotype of leukemic DC (Patient 1) indirect
evidence of leukemic origin by persistence of
aberrant CD4 expression
Successful generation in 5 of 10 patients
67
Non-leukemic DC characteristics
CD80
CD14
CD86
CD83
HLA-DR
Day 5 immature DC
Tumor Ag UV irradiated AML blasts
Ag-pulsing maturation
PI
Annexin V
Successful generation in 10 of 10 patients
68
Leukemic DC x DC of non-leukemic origin
Phenotypic comparison

• Extremely heterogeneous expression profile of
  generated leukemic DC
• Higher and homogeneous expression of maturation
  associated DC markers on the surface of
  pulsed non-leukemic DC

69
Induction of antileukemic cytotoxic T-cell
response
Killing activity of CTL induced by mature
Ag-pulsed DC
Autologous AML blasts
Allogeneic leukemic blasts and autologous
unpulsed DC
Ag-pulsed mature DC
Autologous AML blasts
Allogeneic AML blasts
70
Induction of antileukemic cytotoxic T-cell
response
Only leukemic DC or DC of non-leukemic origin
pulsed with killed AML blasts induce CTL against
autologous leukemic blasts
Patient 1
Patient 2
Killing of autologous leukemic blasts is
inhibited by MHC class I (80) and MHC class II
(40) blocking Abs
71
Summary

• Pulsed non-leukemic DC immunotherapy of AML
• Successful DC generation in all patients
• Homogeneous DC markers expression, unimpaired
  ability and kinetics of maturation
• Detectable CTL induction for all patients tested
  
• Similar cytotoxicity inducing potential for both
  DC preparations

72
Problémy k reení

• které bunky jsou výhodnejí pro produkci DC in
  vitro, CD34 kmenové bunky, nebo monocyty?
• mají vechna maturacní agens stejnou aktivitu a
  schopnost stimulovat DC?
• jakou roli hraje výber aktivacního agens a
  kinetika stimulace DC pro typ vyvolané imunitní
  reakce?
• jaká je optimální forma nádorového antigenu, a
  je tato forma shodná pro ruzné typy nádoru?
• jaké mnoství DC pouít pro vakcinaci, jakou
  zvolit cestu podání, s jakou frekvencí a jak
  dlouho?
• jaké jsou nejlepí indikace pro tento typ lécby,
  jaké onemocnení, jaké stadium, jak skloubit
  imunoterapii a ostatní terapeutické modality?
• jaká je role adjuvancií (GM-CSF, IL-2, IL-12,
  BCG) pri protinádorové imunoterapii?
• jak závaný je vznik autoimmuních reakcí?

73
Podekování
Ústav imunologie Univerzita Karlova, 2.
LF Jirina Bartunková Radek píek Daniela
Roková Zuzana Tobiáová Anna edivá Ondrej
Hruák Jitka Brázová Irena Jareová
Allostem, EU, FP 6