Diapositiva 1

1
ANIMALI TRANSGENICI definizione
Animali transgenici animali ottenuti attraverso
una manipolazione del genoma, inserendo uno o più
geni, appartenenti alla stessa specie, o più
spesso di specie diverse.
2
Vettori retrovirali (terapia genica) Microiniezio
ne del DNA nel pronucleo maschile (in zigoti
fertilizzati) Cellule staminali embrionali
(trasfezione/elettroporazione blastocisti)
3
Cellule staminali embrionali
TOPO CHIMERA
4
È necessario selezionare la progenie per avete
topi con un genotipo omogeneo eterozigote o
omozigote
P1
P2
P3
P1
In P3 lassortimento genotipico segue le regole
mendeliane per lincrocio tra due eterozigoti
Il topo chimerico (P1) puo avere la mutazione
nella linea germinale (in eterozigosi) oppure no.
5
ANIMALI TRANSGENICI come si producono???
Vettori retrovirali Microiniezione del
DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/
gene trapping KO condizionali Trasferimento del
nucleo YAC
GFP
6
STRATEGIE PER LA PRODUZIONE DI ORGANISMI
TRANSGENICI
Gene trapping inserzione in una cassetta
CASUALE Gene targeting inserzione in un gene
SPECIFICO mutagenesi MIRATA
7
GENE TRAPPING
Per fare topi transgenici su vasta scala
generalizzata, senza un solo target...ma anche
per identificare nuovi geni
Gene trapping is a form of insertional
mutagenesis specifically designed to disrupt
gene function by producing intragenic
integration events.
8
Integrazione casuale nel genoma di un costrutto
contenente un gene reporter (entrapment vector)
Integrazione produttiva porta il gene reporter
sotto la regolazione trascrizionale di un gene
endogeno
9
(No Transcript)
10

• Il GENE TRAPPING
• 1) Consente lisolamento di nuovi geni
• 2) Consente la determinazione del profilo di
  espressione del gene intrappolato
• 3) È mutagenico produce knockout

X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter
gene expression associated with a secretory trap
insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson
11
STRATEGIA DEL GENE TRAP
Scelta opportuna del vettore e del sistema di
trasferimento
Selezione dei cloni tramite marker
Localizzazione dellinserto nel clone selezionato
ANALISI DEL FENOTIPO
12
ELEMENTI necessari per gene trap

• Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo
• Entrapment vector contenente
• - gene reporter
• - marker di selezione

13

• Cellule staminali embrionali di Topo

Integrazione Sito specifica
SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel
sito corretto
14

• Geni reporter

• The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal)
• The firefly luciferase gene
• The jelly fish green flourescence protein (GFP)
  gene

Lac Z staining colorazione istochimica che
rivela la presenza della beta-galattosidasi.
Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal,
produce un prodotto insolubile di colore BLU.
Questo metodo visualizza la presenza della
beta-galattosidasi sia nellorgano in toto sia
in specifici tessuti/cellule.
15
Elementi importanti per espressione di un gene e
utilizzati per il GENE TRAPPING
Enhancer corte sequenze che stimolano lattività
trascrizionale di un promotore
Promotore combinazione di elementi ai quali si
lega lRNA polimerasi per iniziare la
trascrizione di un gene
Poliadenilazione aggiunta di circa 200 A
allestremità 3 di un mRNA. La coda poly(A) è
importante per la stabilità dellmRNA
16
Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

• Enhancer trap Vector
• Promoter trap V.
• poly A trap V.
• Gene trap V.

17
Enhancer Trap
Vector
Promotore e pA INDIPENDENTI
Endogenous gene X
P'
lac Z
neo
Promotore MINIMO
pA
pA
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Enhancer
Vector Integration
DNA
lac Z
neo
Promotore MINIMO
lac Z
neo
RNA
PROTEIN X
ß-gal
NeoR
protein
18
Vector
Promoter Trap

• Endogenous gene X

Promotore e pA INDIPENDENTI
PROMOTORE
Promotore ASSENTE
P'
lac Z
neo
pA
pA
Vector Integration
DNA
neo
lac Z
RNA
neo
lac Z
protein
PROTEIN X
ß-gal
NeoR
19
Vector
Poly A Trap
Promotore e pA INDIPENDENTI

• Endogenous gene X

P'
neo
lac Z
SA
SD
Vector Integration
lac Z
neo
SA
DNA
pA
neo
SA
lac Z
RNA
pA
protein
PROTEIN X
NeoR
ß-gal
20
Gene Trap
Vector
Promotore e pA INDIPENDENTI

• Endogenous gene X

P'
Promotore ASSENTE
neo
lac Z
SA
pA
pA
Introne gene X
Vector Integration
neo
lac Z
SA
DNA
Spliced transcript
neo
lac Z
RNA
SA
NeoR
PROTEIN X
protein
ß-gal
Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE
21
Gene Trap
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24

• RICAPITOLANDO..
• Il GENE TRAPPPING consente
• Identificazione NUOVI GENI
• Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
• ANALISI dellESPRESSIONE di GENI

25
GENE TARGETING
PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione
for their work on "principles for introducing
specific gene modifications in mice by the use of
embryonic stem cells and gene targeting.
Mario R. Capecchi
Oliver Smithies
Martin J. Evans
26
GENE TARGETING
Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa
in cellule ES Permette la creazione di una
mutazione in un gene PREDETERMINATO

• Questa mutagenesi può avere come risultato
• INATTIVAZIONE dellespressione di un gene
  (KNOCK-OUT)
• DIMINUZIONE dellespressione di un gene
  (KNOCK-DOWN)
• INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico
  (correzione) (KNOCK-IN)

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE
OMOLOGA
27
IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE
OMOLOGA Nelle cellule di Mammifero la
RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento MOLTO RARO (a
differenza del Lievito) La frequenza di questo
evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di
sequenza tra il DNA introdotto (esogeno) e il
GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata Per
questo il clone di DNA esogeno è una sequenza
ISOGENICA (derivante dallo stesso ceppo murino)
28
vettori utilizzati per GENE TARGETING

• VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI
  KNOCK-OUT)
• 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di
  TOPI KNOCK-IN)

Gene di interesse
Singolo evento di ricombinazione Distruzione del
locus genico KO
M marker esterno alla regione omologa
Gene di interesse

• Doppia ricombinazione
• Sostituzione di parti del locus genico
• Per correggere un gene
• Per produrne forma inattiva

M marker interno alla regione omologa
29
(No Transcript)
30
Un topo KO per un gene X non sempre ha
fenotipo Per effetto di RIDONDANZA GENETICA
(presenza nel genoma di altri geni con funzione
simile) PER QUESTO PUO ESSERE NECESSARIO
PRODURRE DOPPI/TRIPLI KO
DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT
31
esempio di TRIPLO KO
La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM
Ruolo di PIM
32
PIM1 KO nessun FENOTIPO PIM2 KO nessun
FENOTIPO PIM3 KO nessun FENOTIPO
Solo il triplo KO ha un fenotipo
Mice Deficient for All PIM Kinases Display
Reduced Body Size and Impaired Responses to
Hematopoietic Growth Factors
33
esempio di KNOCK-IN
?
Qual è limportanza della FOSFORILAZIONE della
proteina ribosomale S6???
Ruvinsky I. et.al. Genes Dev. 2005192199-2211
34
S6K1 KO rpS6 fosforilata! S6K2 KO rpS6
fosforilata! S6K1/K2 doppioKO rpS6
fosforilata! ..esiste unaltra chinasi (o piu
di una!!) Unica soluzione..RPS6 KNOCK-IN non
fosforilabile
Ribosomal protein S6 phosphorylation is a
determinant of cell size and glucose homeostasis
35
MUTAGENESI CHIMICA/FISICA
Mutagenesi RANDOM LABORIOSA ANALISI FENOTIPO E
IDENTIFICAZIONE GENE MUTATO PER CORRELARE
GENE/FENOTIPO
Mutagenesi chimica ENU (Etil-Nitrosurea)
EMS (Etil-Metilsolfonato
) Mutagenesi fisica raggi X
36
CONFRONTO TECNICHE MUTAGENESI
MUTAGENESI CHIMICA
GENE TARGETING
GENE TRAPPING
37
(No Transcript)
38
G 19/03 PRESENTAZIONE Lez1 ANIMALI
TRANSGENICI G 26/03 OGM (Prof. Gravina)Lez1 G
02/04 OGM (Prof. Gravina)Lez2 G 09/04 Lez2
ANIMALI TRANSGENICI consegna articoli G 16/04
Lez3 ANIMALI TRANSGENICI G 23/04 Lez4
DROSOPHILA G 30/04 Lez5 PIANTE G 07/05 Lez6
PIANTE (3 a lezione) 15m ognuna G 14/05
PRESENTAZIONI 1A 1B 1C (topi
tecniche) G 21/05 PRESENTAZIONI 2A 2B
2C (topi KO K-In) G 28/05 PRESENTAZIONI
3A 3B 3C (topi KO K-In) G 04/06
PRESENTAZIONI 4A 4B 4C
(Drosophila) G 11/06 PRESENTAZIONI 5A
5B 5C (piante)