Diapositiva 1

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SpHPP
SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida
Servicio de Proteómica - Centro Nacional de
Biotecnología
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Síntesis de péptidos para estudios de proteómica
dirigida
Fases

• Selección y diseño de los péptidos para cada
  proteina de interés
• proceso esencial para el éxito de los
  experimentos SRM/MRM
• selección basada en criterios empíricos y
  teóricos
• obtención de péptidos proteotípicos óptimos
• Síntesis química
• Validación experimental de los péptidos
• - previa a la síntesis de los péptidos pesados

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Proteínas de interés
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Proteínas asignadas
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Proteínas de interés
Predicción de PTP Obtención de péptidos
candidatos a péptido proteotípicos por digestión
in silico
Evidencia experimental Observación de péptidos
trípticos en análisis por LC-MS/MS de las
muestras biológicas objeto de estudio
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Proteínas de interés
Predicción de PTP Obtención de péptidos
candidatos a péptido proteotípicos por digestión
in silico
Evidencia experimental Observación de péptidos
trípticos en análisis por LC-MS/MS de las
muestras biológicas objeto de estudio
Selección de péptidos
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Criterios de selección de péptidos

• Únicos para una proteína particular Búsqueda en
  Uniprot/Swiss prot (BLAST)
• 3 a 4 péptidos por proteína
• No missed cleavages
• Longitud entre 6 y 20 aa
• Baja hidrofobicidad valor de 10 a 40 según
  algoritmo SSRCalc (sequence
  
  
  
  specific retention calculator)
• Evitar aa susceptibles de modificación química
• - M y W son fácilmente oxidables
• - N seguida de G ó P tiende a desamidarse
• - Q y E en N term suelen transformarse en
  piroglutámico
• - C en N term tiende a ciclarse si está
  carbamidometilada
• - N en N term es dificil de liberar durante la
  síntesis del péptido
• - D junto con G, P ó S favorece la rúptura de la
  cadena a pH bajo
• - AA ácido en posición P2 ó P2 promueven missed
  cleavage

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Proteínas de interés
Predicción de PTP Obtención de péptidos
candidatos a péptido proteotípicos por digestión
in silico
Evidencia experimental Observación de péptidos
trípticos en análisis por LC-MS/MS de las
muestras biológicas objeto de estudio
Selección de péptidos
Búsqueda de evidencias en BD No todos los
péptidos posibles son observados
experimentalmente. Seleccionar péptidos más
frecuentemente observados en repositorios del
tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas
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Proteínas de interés
Predicción de PTP Obtención de péptidos
candidatos a péptido proteotípicos por digestión
in silico
Evidencia experimental Observación de péptidos
trípticos en análisis por LC-MS/MS de las
muestras biológicas objeto de estudio
Selección de péptidos
Búsqueda de evidencias en BD No todos los
péptidos posibles son observados
experimentalmente. Seleccionar péptidos más
frecuentemente observados en repositorios del
tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas
SINTESIS DE PEPTIDOS
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• Aparato Sintetizador automatizado Multipep de
  Intavis AG
• Método Síntesis en fase sólida (SPPS) sobre
  resinas de polímeros mediante química FMOC
  (grupo protector del amino)
• Formatos placas 96 minicolumnas con filtro con
  capacidad para 1-10 µmol
• Purificación de los péptidos crudos por HPLC
  semipreparativo
• Uso de resinas unidas a Lys ó Arg pesadas (13C y
  15N) para péptidos pesados
• Cuantificación de péptidos pesados purificados
  por análisis de aa ó por
• espectroscopía fluorescencia (kit comercial)

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Péptidos sintetizados crudos ó purificados
Verificación del péptido por MALDI-TOF MS
Validación mediante experimentos LC-MS/MS y
SRM/MRM
Péptidos proteotípicos óptimos
SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS
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Péptido 1 crudo
Péptido 1 purificado
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Péptido 1 crudo
Péptido 1 purificado
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Péptido 3 crudo
Péptido 3 purificado
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Péptido 4 crudo
Péptido 4 purificado
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(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
(No Transcript)
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Podemos concluir de estos resultados que nuestro
método de síntesis es apropiado para la
producción de un gran número de péptidos en
cantidad y calidad aceptable para su uso en
proteómica dirigida.