Paramtres considrer

1
Paramètres à considérer

• Les plantes produisent déjà les précurseurs,
  cest-à-dire lacide linolé?que (182n-6) et
  lacide a-linolénique (183n-3)

?7des
Omega 3
?15des
elo
elo
Omega 6
?12des
?9des
2
Paramètres à considérer

• Les plantes produisent déjà les précurseurs,
  cest-à-dire lacide linolé?que (182n-6) et
  lacide a-linolénique (183n-3)
• Pour transformer les acides gras de plantes en
  LC-PUFAs
• il faut plusieurs enzymes (désaturases,
  élongases, mais aussi
• des acyltransférases, et des enzymes dactivation
  des acides gras)
• Ceci nécessite donc de transformer des plantes
  oléagineuses
• avec plusieurs gènes ? difficultés technologiques

?7des
Omega 3
?15des
elo
elo
Omega 6
?12des
?9des
3
Substrats des désaturases et des élongases
Phospholipid pool
Acyl-CoA pool
a-linolenic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholin
e
183n-3PC
?6des
LPCAT
ACS
Stearidonic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholin
e
184n-3CoA
184n-3 PC
184n-3
?6elo
LPCAT
Eicosatetraenoic acid at sn-2 of
lysophosphatidylcholine
204n-3 PC
204n-3CoA
?5des
Eicosapentaenoic acid at sn-2 of
lysophosphatidylcholine
205n-3 PC
EPA
?6-specific lysophosphatidylcholine
acyltransferase
Acyl-CoA synthetase
4
Les élongases
-Complexe qui regroupe 4 enzymes -La première
enzyme est responsable de la spécificité de
substrat
5
Structure des LC-PUFAs désaturases (front-end
desaturase, front COOH)
(around 450 aa)
Amino acid sequences of membrane-bound fatty acid
desaturases from plants, animals and other
organisms have three strongly conserved
histidine-rich sequences (His boxes) with the
general motifs HXXXH, HXXHH and HXXHH. These
boxes are required for enzyme activity and are
separated by membrane-spanning domains that must
provide the correct orientation for the active
sequences. Many enzymes including the mammalian
?5 and ?6 desaturases contain a cytochrome
b5-like N-terminal extension this is often
accompanied by a change in the third His box to
QXXHH (as shown). Electrons acquired from NADH
cytochrome b5 reductase are transferred to
cytochrome b5 or the cytochrome b5 domain of the
desaturase, and then to the active site of the
desaturase. The mixed oxidation/reduction
reaction proceeds through two iron atoms (green
circles) that are stabilized by interaction with
the conserved histidine boxes.
Wallis et al., TIBS, 2002
6
Les microalgues une large gamme de choix Part of
a maximum-likelihood tree constructed using 18S
rRNA sequences (adapted from Lopez-Garcia P. et
al., Nature, 2001)
(Thalassiosira pseudonana)
(Phaeodactylum tricornutum)
or Nannochloropsis oculata
(Pavlova lutheri, Isochrysis galbana)
7
De nombreux articles décrivent des profils
lipidiques de microalgues
8
Microalgues source de gènes codant pour des
élongases et des désaturases
eicosatrienoic
Oméga 3 désaturase
Cette liste est loin dêtre exhaustive
9
Faisabilité de la reconstitution de la voie de
synthèse du DHA chez un hôte hétérologue
in Yeast 184n-3 ?6elo T. pseudonana ?5des P.
tricornutum ?5elo O. tauri ?4des E.
gracilis ? DHA
DHA 0,5-1 des AG totaux
10
Reconstitution de la voie de synthèse des oméga 3
chez les plantes
Omega 6
Omega 3
?15des
lin
?9elo
?9elo
?6des
?6des
Arabidopsis thaliana
203n-3
184n-3
stearidonic
?8des
?6elo
?8des
?6elo
?5des
?5des
tabac
soja
colza
Oméga 3 désaturase
?5elo
?5elo
- objectif  Si une huile végétale contient
environ  5 dARA, 5 dEPA et 5 de DHA, 10 g
de cette huile (quantité suffisante pour préparer
une vinaigrette) permettraient dingérer la
quantité journalière suffisante de LC-PUFAs 
?4des
?4des
Domergue et al., TIPS, 2005
11
Volume 22, 739-745, 2004
?9elo from I. galbana
X
?6des
203n-3
184n-3
stearidonic
eicosatrienoic
X
?8des from E. gracilis
?6elo
?5des from Mortierella alpina
- Promoteur constitutif - Transformation
séquentielle
12
Ces résultats ont permis de démontrer la
faisabilité de ce type dexpérience chez les
plantes, mais production chez Arabidopsis et dans
les feuilles
13
?6des from P. tricornutum
X
?9elo
203n-3
184n-3
stearidonic
eicosatrienoic
?6elo from moss
X
?8des
?5des from P. tricornutum

• promoteur spécifique des graines
• une seule transformation

? meilleurs résultats avec la construction C
14
Production dEPA que chez le tabac, et dans les
graines
15

• - Plante hôte soja
• - Transformation dembryon somatique par
  biolistique
• - Promoteurs spécifiques des graines
• - Pour la production dEPA 2 constructions
  testées
• (Saprolegnia diclina ?6des Mortierella alpina
  ?6elo Mortierella alpina ?5des)
• (Arabidopsis thaliana ?15des Saprolegnia
  diclina ?17des)
• pour la production de DHA 2 constructions
  testées
• (Saprolegnia diclina ?6des Mortierella alpina
  ?6elo Mortierella alpina ?5des)
• (Pavlova sp. ?5elo Schizochitrium aggregatum
  ?4des Saprolegnia diclina ?17des)

16
(No Transcript)
17
Nouvelles stratégies pour augmenter la production
de LC-PUFAs et le stockage dans les TAGs -
Acyl-transférases - Acyl-CoA synthétase
specifiques de lEPA et du DHA ?
18
Production et stockage des LC-PUFAs
Kennedy pathway AcylTransferases in endoplasmic
reticulum
Glycerol 3-P
G3PAT
Fatty acid synthesis in plastid (until 181),
and in endoplasmic reticulum
lysoPA
acyl-CoA pool
LPAAT
PA
acyl-CoA synthetase
PAPase
FAs
DAG
elo
CPT
260 280 300
DGAT
PC
acyl-CoA
LPCAT
PDAT
TAG
elo elongase ?X ?X-desaturase
lysoPC
19
Addition de nouvelles enzymes acyltransférases
20
(No Transcript)
21
? ARA jusquà 25 EPA jusquà 15
22
Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana
Acyl-CoA synthétase activation des AG AG
ATP acyl-CoA ? acyl-CoA AMP ?
Thalassiosira pseudonana (Diatomée)
Genomic DNA library CNAP server 31.03.03
23
Composition en AG et acyl-CoA de Thalassiosira
pseudonana
co-elution
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
24
Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana
Acyl-CoA synthétases connues
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
25
Expression des gènes TpLACS
t3
t4
t2
t1
1 2 3 4 1 2 3
4 1 2 3 4 1 2
3 4
18S rDNA (675 bp)
TplacsA (324 bp)
TplacsI (543 bp)
expression hétérologue dans la levure
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
26
Expression de TplacsA dans les levures et
incubation en présence de 184n3205n3
Résultats similaires en présence de 183n6204n6
? TpLACSA peut activer les LC-PUFAs
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
27
Activité spécifique de TpLACSA
PACS Pseudomanas sp. acyl-CoA synthetase
(Sigma), connue pour son spectre large dactivité
80
2000
pYES2
pYLACSA

PACS
1500
60
PACS specific activity (pmole/min/mg protein)
Yeast extracts specific activity (pmole/min/mg
protein)
40
1000
20
500
0
0
160 183n-6 184n-3
204n-6 205n-3
226n-3

Fatty acid substrate
TpLACSA est très active sur les LC-PUFAs, en
particulier le DHA
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
28
TpLACSA peut-elle augmenter le stockage du DHA
dans la levure?
La réponse est oui ? prochaine étape expression
chez la plante
Tonon et al., Plant Physiology, 2005
29
(No Transcript)