Diapositiva 1

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GENÓMICA FUNCIONAL PARA LA MEJORA GENÉTICA DEL
RODABALLO
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PRINCIPALES PROBLEMAS CULTIVO DE RODABALLO
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Proyectos de genómica coordinados Consolider,
Genoma-España, Genoma-Galicia
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ESTRATEGIAS GENÓMICAS PARA LA MEJORA DEL CULTIVO
DE RODABALLO
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Estimación de la cantidad de ADN en rodaballo
C0.65pg
(Cuñado et al., 2001 Genome)
6
ANÁLISIS CARIOTÍPICO DE RODABALLO
7
DISEÑO APLICACIÓN DE UN MICROARRAY PARA DETECCIÓN
DE GENES DE RESISTENCIA A PATOLOGÍAS
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El análisis de microarrays tiene una enorme
potencialidad, ya que permite estudiar
simultáneamente el patrón de expresión de cientos
o miles de genes y de sus interacciones. Sin
embargo, esta metodología tiene su contrapartida,
ya que su aplicación implica el control y
limitación de las diversas fuentes de error
asociadas a cada una de las etapas del análisis
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ETAPAS DEL ANÁLISIS DE MICROARRAYS
Marcaje
Muestra tejido
Aislamient. ARNm
Hibridación
Muestra tejido
Muestra tejido
Escaneado
Análisis estadístico
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ASPECTOS TÉCNICOS DEL ANÁLISIS DE MICROARRAYS

1. Diseño sondas (Tª, especificidad)
2. Fijación al sustrato
3. Interfaz de hibridación

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TIPOS DE SUPERFICIES aminosilano
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IMPRESIÓN/SÍNTESIS DE LAS SONDAS EN EL ARRAY
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EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL ARN
18S
28S
Buena calidad
ARN degradado
Parcialmente degradado
5.8S tRNA
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MARCAJE DEL cDNA 1/2 colores
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MEDIDA DE LA INTENSIDAD DE HIBRIDACIÓN SCANNER
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CAPTURA DE IMAGEN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
Intensidad y color
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VARIABLES A TENER EN CUENTA PARA LAS PRESTACIONES
DE LOS MICROARRAYS

• Exactitud concordancia entre el valor obtenido y
  el verdadero de la expresión de un gen
• Precisión reproducibilidad, tiene que ver con el
  error de la medida
• Especificidad capacidad de una sonda de unirse y
  valorar la expresión de la diana para la que fue
  diseñada
• Sensibilidad rango en el cual se pueden obtener
  medidas precisas de expresión

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FUENTES DE VARIACIÓN

1. Diseño y calidad de impresión de las sondas
   (home-made, casas comerciales)
2. Diferencias biológicas (análisis indiv/poblac)
3. Extracción del ARN degradación diferencial
4. Obtención cDNA (retrotranscripción)
5. Marcaje homogéneo
6. Hibridación de la muestra sobre el microarray
7. Experimentador

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DESARROLLO DE UN MICROARRAY DE OLIGOs EN
RODABALLO CON ESPECIAL ÉNFASIS EN ÓRGANOS INMUNES
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DISEÑO EXPERIMENTAL
Tejidos linfoides Bazo (B) Hígado (H)
Riñón (R)
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CONSTRUCCIÓN DE LIBRERIAS de ADNc
Extracción y evaluación calidad ARN (Trizol)
Homogenizado de pooles (N2 líquido)
28S
18S
5S
Purificación ARNm (Dynabeads Oligo dT25)
Librerías de ADNc (ZAP-cDNA Library Construction
kit)
Figura cDNA synthesis kit (Stratagene)
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SECUENCIACIÓN 20.000 ESTs
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BASE DE DATOS ESTs Y MICROARRAYS
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CARACTERÍSTICAS BASE DE DATOS RODABALLO
(TURBOT-DATABASE v.2.0)

1. 16.514 secuencias de calidad (gt100pb PHREDgt20)
2. Librerías de cDNA de infecciones con Aeromonas
   (4.000), Philasterides (4.000), Nodavirus
   (3.000), Enteromyxum (2.000), controles (6.000)
   librerías enriquecidas microsatélites (1.400)
3. Procedentes órganos linfoides hígado, riñón,
   bazo, timo y ciegos pilóricos
4. Secuenciadas desde 3 mayoritariamente
5. 6.170 secuencias únicas 1.827 contigs 4.343
   singletons
6. Anotación funcional del 45 de las secuencias

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(No Transcript)
26
Nuevas funciones de la opción Búsqueda.
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Diseño de Oligos Incorpora una herramienta que
permite diseñar los oligos para el microarrray
28
Búsqueda de funciones proteicas. Incorpora una
herramienta que permite explorar las secuencias
para buscar dominios, familias y lugares
funcionales proteicos. Debido a que estas
herramientas están todavía poco desarrolladas
pueden servir como ayuda, pero sus resultados no
son definitivos.
Cada una parte de su propia base datos de
proteinas en la que buscan motivos proteicos por
funciones para poder contrastar la secuencia
aminoacídica del ADN problema
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Visor de contigs y localizador de SNPs. Incorpora
una herramienta que permite explorar las
secuencias para analizar la composición de los
Contigs, la secuencia consenso, microsatélites y
específicamente la búsqueda de SNPs.
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IDENTIFICACIÓN DE SNPs
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Mejoras en la Base de Datos (BD) de Rodaballo
versión 2.0
Mejora del Blast local. Se incorporan 3 genomas
de especies modelo.
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DISEÑO DEL OLIGO-MICROARRAY

• Se codificó en BioPerl un programa que usa
  RepeatMasker (http//www.repeatmasker.org/ ) para
  eliminar los fragmentos de baja complejidad de
  las secuencias
• MFold/UNAFold (http//dinamelt.bioinfo.rpi.edu/do
  wnload.php) para predecir los posibles problemas
  con la estructura secundaria y  autohibridación
• OligoArray 2.1 (http//berry.engin.umich.edu/olig
  oarray2_1/ ) para la selección final de oligos

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DISEÑO E IMPRESIÓN DEL MICROARRAY
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Spatial Distribution of All Outliers on the
Array 192 rows x 82 columns
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INFORME CALIDAD COEF. VARIAC./INTENS SEÑAL
(SpikeIns)
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DIAGRAMA DE FLUJO EN EL ANÁLISIS DE MICROARRAYS
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ANÁLISIS DE LA FUENTE DE VARIACIÓN EN EL
MICROARRAY
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CORRELACIÓN ENTRE RÉPLICAS DE LOS FACTORES DE
VARIACIÓN EN EL OLIGO-MICROARRAY v1.0
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COEFICIENTE DE VARIACIÓN ATRIBUIBLE A LOS
DISTINTOS FACTORES
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Proteína de unión a insulina
41
Triptófano dioxigenasa
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GENES REGULADOS RESPUESTA AEROMOMAS SALMONICIDA
Information Functional classification Clones E-Value Accession Hit Species Fold change
Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1 Signal perception and transduction 1 7,00E-18 DQ146965.2 O. mykiss 3,967
Antifreeze polypeptide (AFP) precursor Stress and/or defence response 52 3,00E-06 DY223260.1 P. saltatrix 3,784
C1 inhibitor Stress and/or defence response 19 5,00E-29 CAD58653.1 O. mykiss 3,552
Complement binding protein Stress and/or defence response 2 6,00E-10 CN655676.1 H. hippoglossus 3,366
Complement component C9 Stress and/or defence response 11 8,00E-50 DV569533.1 P. flesus 3,972
Complement regulatory plasma protein Stress and/or defence response 2 1,00E-37 AAA92556.1 P. nebulifer 3,055
Complement C3 Stress and/or defence response 25 4,00E-55 BAA88901.1 P. olivaceus 3,792
Complement C8B Stress and/or defence response 1 3,00E-27 CAC27528.1 P. flesus 4,282
Gelatinase, matrix metalloproteinase 9 Stress and/or defence response 3 2,00E-40 DV568612.1 P. flesus 2,095
Haptoglobin fragment 1 Stress and/or defence response 38 6,00E-12 AAG30004.1 O. mykiss 6,029
Hepcidin precursor Stress and/or defence response 5 3,00E-35 AAX92671.1 S. maximus 3,426
Kininogen 1 Stress and/or defence response 10 2,00E-17 NP_001005981.1 D. rerio 2,441
Saxitoxin binding protein1 Stress and/or defence response 23 2,00E-13 BAB55581.2 T. pardalis 2,964
Warm temperature acclimation related 65kDa protein Stress and/or defence response 18 1,00E-30 BAD98538.1 O. latipes 4,775
Beta microseminoprotein A1 precursor Unclassified functions 14 2,00E-31 DV565973.1 P. flesus 3,413
Inter alpha inhibitor H2 Unclassified functions 3 8,00E-19 CAI11852.1 D. rerio 2,055
TBT-binding protein Unclassified functions 32 2,00E-10 CO575935.1 P.americanus 4,128
Clon cDNA Dicentrarchus labrax Unknown function 5 3,00E-05 DV217032.1 D. labrax 2,267
Clon cDNA Perca fluviatilis Unknown function 9 1,00E-38 DY615092.1 P. fluviatilis 3,431
Drtp1 Unknown function 9 7,00E-06 ABE02825.1 P. crocea 4,562
Mantle gene 8 Unknown function 9 2,00E-12 AAZ76262.1 P. fucata 5,461
No information Unknown function 3 2,064
No information Unknown function 1 -2,080
Toxin 1 Unknown function 7 3,00E-20 AAM21198.1 O. mykiss 3,006
Unnamed protein product Unknown function 7 3,00E-17 CAF95502.1 T.nigroviridis 3,330
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ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA EVALUACIÓN DE LA
RESPUESTA INMUNE EN RODABALLO
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ANÁLISIS ESTADÍSTICO GENES REGULADOS AER-BAZO.I
Grupo significativo de 89 genes con similar
patrón de expresión
Dendrograma patrones expresión
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EXPRESIÓN DIFERENCIAL ENTRE PATÓGENOS AEROMONAS
vs PHILASTERIDES
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EXPRESIÓN DIFERENCIAL ENTRE TEJIDOS (bazo,
hígado, riñón)
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EXPRESIÓN DIFERENCIAL EN EL TIEMPO
48
RELACIONES INTERGÉNICAS
49
RELACIONES INTERGÉNICAS
50
RELACIONES INTERGÉNICAS
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(No Transcript)
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FUNCIONES ENRIQUECIDAS USANDO GENOMA HUMANO COMO
BACKGROUND
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VALIDACIÓN DEL OLIGO-MICROARRAY

1. Selección aleatoria y estratificada de un
   conjunto de 15 genes en el microarray
2. Selección del microarray idóneo para la
   validación entre los 30 utilizados
   disponibilidad del mayor rango de ratios y de
   número de genes por intervalo de ratios para la
   validación
3. Análisis de expresión mediant Qt-PCR

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ID Sequence Definition Fold Change Microarray
R1__688 Ribosomal protein S4 (RPS4) 0.085
R1__748 Ubiquitin_A-52_residue_ribosomal_protein_fusion_product_1 -0.038
R1__69 Glyceraldehyde-3-phosphate_dehydrogenase 0.56
R1__517 Clon cDNA Hippoglossus hippoglossus 2,225
R1__597 Unnamed protein product Tetraodon nigroviridis 2,714 
R1__297 UDP-glucose pyrophosphorylase 2 3,248
R1__2649 No informacion 3,647
R1__753 No informacion 3,912
R1__42 Clon cDNA Gasterosteus aculeatus 4,673
R1__75 Alcohol Deshidrogenasa 8 (eliminar xenobioticos Citocromo P450) 4,817
R1__766 Antifreeze polypeptide (AFP) precursor 5,234 
R1__481 Apolipoprotein C-I precursor 5,952 
R1__1072 Clon cDNA Hippoglossus hippoglossus 6,107 
R1__499 TBT-binding protein 6,823 
R1__901 No informacion 7,123 
R1__127 Clon cDNA Paralichthys olivaceus 7,517 
R1__230 Unnamed protein product Tetraodon nigroviridis 8,210 
HOUSEKEPPING
GENES
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(No Transcript)
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Grupo de Patología en Acuicultura USC Sección de
Genómica de Patógenos Bacterianos IP Manuel L.
Lemos Ramos
Grupo de Inmunología e Ictioparasitología USC
IP Manuel Sanmartín Durán
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Grupo de Matemática Aplicada y Bioinformática
USC IP José Antonio Alvarez Dios
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CETGA - Cluster de Acuicultura de Galicia
Director Santiago Cabaleiro
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Genética para la Acuicultura y la Conservación de
Recursos (ACUIGEN- USC)