Diapositiva 1

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Aplicaciones de la técnica de DGGE en
biodiversidad.
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• Estudiar diversidad de microorganismos
  ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA)
  o diversidad de genes catabólicos.
• Estudiar las poblaciones con actividad metabólica
  o genes activos por análisis de productos de
  RT-PCR
• Estudiar la distribución espacial y temporal de
  poblaciones bacterianas monitoreo en el tiempo
• Analizar cómo varía la composición de las
  poblaciones frente a cambios ambientales
  (contaminación, clima, perturbación)
• Buscar microorganismos indicadores y
  específicos
• Monitorear la liberación de microorganismos
  genéticamente modificados
• Screening de mutaciones en genes específicos
  diagnóstico de enfermedades

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• Estudiar diversidad de microorganismos
  ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA)
  o diversidad de genes catabólicos.

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FIG. 1. DGGE patterns produced from 16S rDNA (A)
and 16S rRNA (B) templates isolated from
chrysanthemum rhizosphere samples. Samples were
taken from either root tips (lanes 1 through 8)
or root bases (lanes 9 through 16), from plants
harvested at the ages indicated at the top. Two
samples from each developmental stage and root
system location were analyzed and were numbered
sequentially as shown above the lanes. Lanes,
Bu-1, and Bu-2, contained samples from bulk soil.
Lanes M contained a DGGE marker, consisting of a
mixture of 16S rDNA fragments. The marker bands
in the marker lanes are as follows 1,
Enterobacter cloacae BE1 2, Listeria innocua
ALM105 3, Rhizobium leguminosarum subsp.
trifolii 4, Arthrobacter sp. 5, Pseudomonas
cepacia P2. Uppercase letters indicate bands from
the DNA-derived DGGE patterns that were excised
for sequence analysis, while lowercase letters
indicate bands from the RNA-derived patterns with
identical sequences (Table 1). The asterisks
indicate that excised band J produced an
ambiguous sequence, probably due to the presence
of multiple DNA fragments within this band.
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• Estudiar la distribución espacial y temporal de
  poblaciones bacterianas monitoreo en el tiempo

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Bacterial Population Changes in a Membrane
Bioreactor for Graywater Treatment Monitored by
Denaturing Gradient Gel Electrophoretic Analysis
of 16S rRNA Gene Fragments

• Analizar cómo varía la composición de las
  poblaciones frente a cambios ambientales
  (contaminación, clima, perturbación)

FIG. 3. DGGE of PCR-amplified region 338 to 518
of 16S rDNA from the GMBR bacterial community.
Lane labels along the top show sampling time
(days) from startup of the bioreactor and
migration standards (std). Values along the
bottom indicate the SDI.
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• Buscar microorganismos indicadores y
  específicos

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• Screening de mutaciones en genes específicos
  diagnóstico de enfermedades

Molecular evolution of Aldolase A pseudogenes in
mice multiple origins, subsequent duplications,
and heterogeneity of evolutionary rates.
FIG. 2.Parallel DGGE results. Multiple bands
were obtained using primers ALD61CG/ALD11. a,
Patterns found in the complete sample. Similar
migrating bands are indicated with an asterisk.
b, Interspecific and intrapopulational pattern of
variation. b and c are scanned images from
silver-stained gels. Note that more than two
sequences were found per individual (indicating
the presence of more than one locus). c,Patterns
obtained in different laboratory strains, Mus
pahari and Mus spicilegus.
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Ventajas
-         La secuenciación individual de bandas
puede revelar información filogenética ?
se evita la clonación y la selección previa
secuenciación
-         Análisis de hibridación de los perfiles
con sondas específicas de grupo (Agrobacterium
tumefasciens)
-         Se pueden correr simultáneamente
fragmentos patrones correspondientes a grupos o
especies específicas ? identificación
directa
-         El bandeo complejo puede reducirse
usando primers específicos de grupo
(cyanobacterias, agrobacteria, actinomycetes)
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Ventajas

• Amplificar fragmentos de genes funcionales
  presentes en grupos particulares de bacterias
  (NiFe hidrogenasas en Desulfovibrio)

• Análisis simultáneo de gran cantidad de
  muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con
  30 calles c/u en 3 hs)

• Se pueden identificar las bandas si se corren
  simultáneamente patrones especificos

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Desventajas

• no se pueden correr más de 500 pb

• existen diferencias gel a gel, pero las
  posiciones relativas de las bandas permanecen
  estables

• hasta que una banda en el gel es verificada, la
  sola posición en el gradiente no tiene
  significado

• no es posible separar fragmentos de DNA con
  cierta cantidad de variación de secuencia

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Desventajas

• se pueden observar bandas dobles como
  resultado de la presencia de bases balanceantes
  en primers degenerados

• solamente muestra los fragmentos de DNA de las
  especies predominantes de la comunidad (se estima
  que las bacterias que estén en proporción
  superior al 1)

• la microheterogeneidad de secuencias y la
  presencia de múltiples operones pueden llevar a
  una sobrestimación del nº de bacterias de una
  comunidad.

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Limitaciones de la técnica

• 1.    Manipuleo en la toma de la muestra
  condiciones de muestreo y mantenimiento de la
  muestra
• 2.    Extracción de ácidos nucleicos lisis
  reproducible de todas las bacterias, remoción de
  sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács.
  húmicos, exopolisacáridos) 
• 3.    Reacción de PCR
• -         Amplificación diferencial o
  preferencial (por renaturalización del templado) 
• -         Formación de heterodúplex
  (renaturalización de productos de PCR)

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Conclusiones

• ? DGGE ofrece una rápida detección de las
  poblaciones predominantes AMPLIFICABLES. 
• ? Detecta rápidamente diferencias en las
  secuencias de fragmentos de genes homólogos
  amplificados por PCR.

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(No Transcript)
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Microbial community fingerprinting

• Terminal-restriction fragment length polymorphism
  (T-RFLP)

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Why do we focus on rRNA?

• RNA content/cell
• 80 of cellular RNA is rRNA
• 15 of cellular RNA is tRNA
• 5 of cellular RNA is mRNA

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Microbial aspects of biodiversity

• It is almost impossible to quantify the abundance
  of an uncultured organism
• The possibility to perform environmental
  genomics opens a perspective to assess the
  physiological potential of yet uncultured
  microorganisms

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Precautions

• Known 16S rRNA gene heterogeneities might be up
  to 5-6 of sequence dissimilarity (Haloarcula,
  Thermobispora)
• Proper studies should contribute with good
  quality rRNA sequences (e.g. avoiding PCR
  artefacts) and must be conducted on
  well-documented samples from characterised sites,
  preferably accompanied by cultivation and
  hybridization experiments

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Why looking at microbial diversity ?

• Strategies and limits of life
• Roles of microorganisms in biogeochemical cycles
• A source for biotechnology
• For monitoring environmental changes
• To protect higher organisms
• For understanding ecology and evolution principles

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How to assess microbial diversity

• Sequence analysis of randomly picked clone
  inserts
• Hybridization with taxon-specific probes
• RFLP
• ARDRA
• DGGE
• TGGE
• T-RFLP

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Terminal-restriction fragment length polymorphism
(T-RFLP)

• Culture-independent technique for screening
  microbial communities
• Based on PCR amplification of the phylogenetic
  marker 16S rRNA gene
• Aspects for consideration 1) detection limits,
  2) reproducibility, 3) biological question to
  address overall diversity predominant
  members population dynamics, etc

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Fluorescently labelled primers

• Universal primer pair FAM63F and HEX1389R (E.
  coli numbering)
• According to systematic testing, more useful for
  ecological studies
• Amplifies most of the 16S rRNA gene

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The T-RFLP protocol
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• Extraction of community DNA or RNA from
  environmental samples
• PCR amplification of 16S rRNA gene with
  fluorescent primers
• Digestion with restriction enzymes (e.g. CfoI,
  AluI)
• Detection and sizing of labelled terminal
  fragments by capillary or gel electrophoresis

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CfoI
CfoI profile
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T-RFLP profileElectropherogram

• Different fragments come from different organisms
• Different organisms may share a common terminal
  fragment size
• Peak height in principle correlates to the
  abundance of a group of organisms (?)

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T-RFLP profile rRNA operon number
CfoI profile
AluI profile
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Pros and cons of T-RFLP

• LIMITATIONS
• Biases inherent to PCR-based techniques
• Data generated depend on the choice of
  restriction enzymes
• A large group of organisms may share the same
  terminal fragment size
• Apparent size may differ from actual size and
  varies with the type of genetic analyser

• ADVANTAGES
• Straightforward technique
• High reproducibility at each step of the process
• Highly precise (if not always accurate)
• Digital data can be objectively processed

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Population dynamics
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Population dynamics